COVID-19 обычно диагностируется путем амплификации РНК SARS-CoV-2 из носоглоточной жидкости методом ПЦР с обратной транскрипцией (RT-PCR).
RT-PCR дает значения порога цикла (Ct), которые обратно коррелируют с вирусной нагрузкой и, таким образом, позволяют оценить количество копий РНК SARS-CoV-2 в образце. Серологические анализы дополняют диагностику COVID-19, документируя перенесенные инфекции. У большинства людей связывающие и нейтрализующие антитела вырабатываются в течение 1-3 недель после появления симптомов, а титры коррелируют с тяжестью заболевания.
Первоначальные серообследования выявили антитела почти у 100% лиц с подтвержденной методом RT-PCR инфекцией SARS-CoV-2. Однако более поздние исследования показали, что показатели сероконверсии удивительно изменчивы. Например, в многоцентровом исследовании, проведенном в Израиле, сообщалось, что 5% участников оставались серонегативными, несмотря на положительный результат анализа образца назального мазка. В отличие от этого, исследование серопревалентности, проведенное в Нью-Йорке, показало, что 20% людей с положительным результатом теста RT-PCR не сероконвертировались. В другом исследовании, проведенном в Германии, сообщалось, что у 85% подтвержденных инфицированных контактов COVID-19 антитела не выработались.
Чтобы изучить причины этих различий, мы исследовали связь между сероконверсией и демографическими, клиническими и лабораторными данными в выборке выздоровевших людей, набранных в Университете Алабамы в Бирмингеме (Бирмингем, Алабама, США) в 2020 году. Мы обследовали 72 человека, у всех из которых ранее был положительный тест RT-PCR, но до забора крови на анализ в течение >3 недель не было симптомов. Только 2 человека (3%) сообщили об отсутствии симптомов, в то время как 13 (18%) человек сообщили о легкой форме заболевания, 48 (67%) - об умеренной и 9 (12%) - о тяжелой. Мы протестировали образцы плазмы (n = 144), собранные во время регистрации и последующих визитов, на наличие антител к белку шипа с помощью валидированного ИФА. Только у 46 из 72 участников были выявлены IgG-ответы, IgA-ответы или и то, и другое; титры в варьировали от 182 до > 312 500. Анализ тех же образцов на наличие антител к рецептор-связывающему домену (RBD) и нуклеокапсиду (N) дал очень похожие результаты.
У всех лиц с антителами к белку спайка также были выявлены реакции на белок RBD (IgG, IgM или оба) или N (IgG), за исключением одного участника, у которого титры были очень низкими. Напротив, 26 участников остались серонегативными, несмотря на тестирование до 3 образцов на IgA, IgM и IgG против нескольких антигенов, а также нейтрализующих антител. Таким образом, 36% нашей когорты представляли собой серологически не реагирующих участников.
Чтобы выяснить возможные причины отсутствия сероконверсии, мы изучили имеющиеся демографические, клинические и лабораторные данные. Сравнивая расовую/этническую принадлежность, пол и выраженность симптомов, мы не обнаружили значительной связи с серостатусом, хотя мы наблюдали тенденцию к увеличению позитивности антител с увеличением выраженности симптомов. Мы также не обнаружили существенных различий в сероконверсии между пациентами, сообщающими и не сообщающими о различных симптомах, включая симптомы, характерные для COVID-19.
Однако серонегативные лица были в среднем на 10 (95% ДИ 3-17) лет моложе серопозитивных лиц и имели значения Ct RT-PCR на 11 (95% ДИ 8-14) циклов выше. Более того, логистическая регрессия показала резкое снижение вероятности сероконверсии при более высоких значениях Ct. Например, Ct 35 предсказывал только 15% (95% ДИ 5%-37%) вероятность сероконверсии, которая еще больше снижалась с увеличением значения Ct. Таким образом, низкая назофарингеальная вирусная нагрузка выглядит недостаточной для того, чтобы вызвать системный ответ антител.
Для контроля мы построили график зависимости значений Ct серологических респондентов и нереспондентов от времени проведения RT-PCR и тестирования на антитела относительно начала симптомов. В обоих случаях распределения времени взятия проб были одинаковыми для двух групп, что исключает возможность того, что серонегативные лица имели более высокие значения Ct, потому что они были протестированы слишком поздно, или что у них отсутствовали антитела, потому что они были протестированы слишком рано. Мы также исследовали остатки очищенной РНК, использованной для первоначальной диагностики, на наличие сиквенсов SARS-CoV-2. Проанализировав 12 доступных образцов, мы смогли амплифицировать полноразмерные интактные гены спайков из 4 образцов, включая 2 от серонегативных лиц с высокими значениями Ct.
Наконец, мы задались вопросом, зависит ли связь между сероконверсией, возрастом и значениями Ct от диагностической лаборатории. Мы обнаружили, что в двух лабораториях с высокочувствительными тестами RT-PCR (референс-лаборатория грибковых заболеваний Университета Алабамы в Бирмингеме и детская лаборатория диагностической вирусологии Алабамы в Бирмингеме) в 6 (95% ДИ 2-30) раз выше вероятность выявления серологических неответчиков, чем в третьей лаборатории с менее чувствительным тестом (Assurance Scientific Laboratories в Бирмингеме). Однако это различие не изменило связь между значениями Ct и сероконверсией, поскольку у серонегативных лиц значения Ct были выше, чем у серопозитивных, независимо от места проведения теста. В отличие от этого, мы наблюдали незначительную связь между возрастом и сероконверсией на сайте Assurance Scientific Laboratories, а разница, наблюдаемая на других сайтах, была в основном обусловлена молодыми людьми, которые также имели высокие значения Ct. Таким образом, носоглоточная вирусная нагрузка представляет собой основной коррелят системного ответа на антитела, в то время как возраст, по-видимому, оказывает лишь незначительное влияние.
В итоге мы показали, что у пациентов с низкой вирусной нагрузкой SARS-CoV-2 в дыхательных путях меньше вероятность появления системного ответа на антитела. Хотя мы не можем формально исключить ложноположительные результаты RT-PCR у некоторых участников, контаминация ПЦР крайне маловероятна в качестве объяснения наших результатов. Мы также показали, что клиническое заболевание не гарантирует сероконверсию, и что лаборатории с высокочувствительными анализами RT-PCR с большей вероятностью выявят серологически не реагирующих людей. Эти результаты дают объяснение озадачивающей вариабельности сероконверсии в разных когортах.
Тот факт, что значительная часть лиц с положительным результатом RT-PCR не сероконвертируется, имеет практическое значение. Такие люди остаются необнаруженными в исследованиях серораспространенности, в том числе в исследованиях вакцин, которые оценивают защиту от бессимптомной инфекции путем измерения антител к антигенам, не включенным в вакцину. Сероконвертеры и несероконвертеры, вероятно, также будут по-разному реагировать на вакцинацию. Недавние исследования показали, что серопозитивные лица имеют повышенный ответ антител после первой, но не второй дозы мРНК-вакцины, что позволяет предположить, что достаточно одной дозы. Лица с положительным результатом RT-PCR, которые испытывали симптомы COVID-19, могут быть менее склонны обращаться за вакцинацией, считая, что они защищены, но наши результаты предостерегают от этого предположения.
