Секвенирование следующего поколения: применение в отношении патогенных микроорганизмов пищевого происхождения (аннотация)Секвенирование следующего поколения: применение в отношении патогенных микроорганизмов пищевого происхождения
Хотя полный геном бактерии, а именно одного из штаммов Haemophilus influenzae, был впервые секвенирован в начале 1990-х годов, рутинное внедрение методов секвенирования в лаборатории безопасности пищевых продуктов все еще остается несбыточной мечтой.
Хотя с развитием секвенирования по Сэнгеру увеличилось число исследований геномной характеристики патогенов пищевого происхождения, только во втором десятилетии XXI века технологии секвенирования произвели революцию в области безопасности пищевых продуктов благодаря появлению массового секвенирования. Одним из наиболее используемых приложений стало полногеномное секвенирование (WGS), которое позволило перейти от фенотипической к генотипической характеристике бактерий. Эта технология позволяет определять вирулентность и резистентность, геномную характеристику, а также определять филогенетические связи между изолятами, что особенно полезно при расследовании вспышек заболеваний.
Параллельно с этой технологией был разработан целый ряд биоинформационных методов. Более того, в последние годы использование биоинформационного программного обеспечения стало демократичным благодаря появлению веб-платформ, которые позволяют использовать эти программы исследователям с ограниченными знаниями в области биоинформатики. В данном обзоре собраны статьи, демонстрирующие потенциал массового секвенирования в области безопасности пищевых продуктов, выходящий за рамки "классических" применений.
Brown et al. секвенировали 88 изолятов Listeria monocytogenes с пяти молокоперерабатывающих предприятий, собранных в период с 2007 по 2017 год в одном и том же регионе. Авторы провели анализ мультилокусных последовательностей (MLST), клонального комплекса, MLST основного генома (cgMLST), аллельного профиля sigB и SNP-анализ всего генома. Результаты показали 11 cgMLST типов, и большинство штаммов принадлежали к линии II, одной из наиболее распространенных в пищевых продуктах.
Распределение генов вирулентности варьировалось среди разных изолятов и разных фермерских хозяйств. Но самое интересное, что 60 штаммов из 72, выделенных с одного и того же предприятия в разные годы, имели высокое сходство (от 0 до 16 SNPs), что дает представление о способности штаммов L. monocytogenes к персистенции в окружающей среде и в пищевой промышленности.
Также сфокусировавшись на L. monocytogenes, Jeong et al. провели полное исследование на цехе по убою кур в течение 3 лет (2019-2021 гг.). В этом исследовании пробы были взяты в разных точках цеха убоя для выявления путей контаминации, а присутствие L. monocytogenes определялось культурально-зависимым и независимым методами. С помощью секвенирования ампликонов 16s РНК удалось проследить основные источники контаминации куриных тушек во время убоя, что особенно важно для определения критических точек, требующих особого мониторинга.
Zhong et al. провели WGS 186 изолятов Clostridium perfringens, собранных в Китае в период с 2013 по 2021 год от людей, животных и из продуктов питания. Результаты показали большое генетическое разнообразие изолятов, включающее 135 различных типов последовательностей (ST), при этом у проанализированных изолятов не было обнаружено связи между хозяином, географическим распространением или токсинотипом. Исследователи также отметили высокую распространенность генов резистентности к тетрациклину. Эти исследования имеют большое значение для выяснения филогенетических связей между штаммами, распространенными в стране на протяжении многих лет, и выявления особо опасных линий.
Данные WGS, помещенные в базы данных, также очень полезны для понимания поведения патогенов, передающихся с пищей. Mao et al. проанализировали факторы sigB из 46 921 генома L. monocytogenes, имеющихся в базе данных NCBI. Исследователи обнаружили два основных варианта белка - SigB типа I и SigB типа II. Кроме того, вариант SigB типа I в основном коррелировал с линиями I и III, а SigB типа II - с линией II. Фенотипические исследования продемонстрировали большую способность SigB типа I способствовать инвазии клеток, цитотоксичности, формированию биопленки и холодоустойчивости. Подобные исследования демонстрируют важность анализа геномных данных штаммов, выделенных по всему миру, для понимания факторов, связанных с патогенезом пищевых патогенов.
Разработка секвенирования с длинными чтениями компаниями Pacific Biosciences, известной как PacBio, и Oxford Nanopore Technologies (ONT) произвела революцию в этой области исследований. В частности, ONT позволило использовать массовое секвенирование в лабораториях безопасности пищевых продуктов как для идентификации, так и для характеристики патогенов благодаря низким начальным инвестициям, необходимым для внедрения этой технологии в лабораториях с использованием оборудования MinION. Несколько статей в рамках данного обзора были посвящены применению этой конкретной технологии.
Lamas et al. выбрали одноразовые проточные кюветы ONT Flongle в сочетании с веб-платформой Galaxy для быстрого серотипирования изолятов Salmonella, а также для характеристики геномной антимикробной резистентности и вирулентности. В этой статье описан пошаговый протокол секвенирования и биоинформационного анализа изолятов Salmonella, который может применяться в лабораториях с ограниченными ресурсами и биоинформационными навыками.
Другой подход основан на использовании метагеномики. Maguire et al. использовали этот подход для обнаружения продуцирующих токсин Шига Escherichia coli в сельскохозяйственных стоках, включая короткий этап обогащения перед выделением ДНК из образца. Они провели метагеномику с использованием коротких чтений Illumina отдельно или в сочетании с длинными прочтениями ONT и определили, какой вариант лучше всего подходит для характеристики выделенных штаммов и установления филогении в случае вспышки заболевания. Результаты показали, что предел обнаружения составляет от 105 до 107 КОЕ/мл, и что при наличии не менее 107 КОЕ/мл возможно получить полный фрагментированный геном с помощью гибридной сборки, с правильной идентификацией серотипа и генов вирулентности по сравнению с эталонной сборкой.
Buytaers et al. разработали другой метагеномный подход. Одним из ограничений метагеномики при идентификации патогенов в сложных образцах является интерференция с ДНК других бактерий и/или хозяина/пищевых продуктов. Если не проводить целенаправленное секвенирование, то значительная часть секвенированной ДНК будет соответствовать этому мешающему генетическому материалу, что ограничивает получаемые результаты. Для решения этой проблемы исследователи использовали нанопоровый адаптивный сэмплинг. Это можно считать программно-направленным обогащением. Благодаря использованию эталонных баз данных, введенных пользователем, секвенируются только те чтения, которые представляют интерес.
С помощью этой стратегии авторы смогли идентифицировать, охарактеризовать и провести филогенетический анализ золотистого стафилококка, присутствующего в образцах искусственно загрязненного картофельного пюре, без необходимости предварительного обогащения. Более того, они продемонстрировали, что эта стратегия более эффективна, чем использование наборов для выделения, которые устраняют ДНК хозяина.
