Бактериофаги являются наиболее распространенными биологическими существами на Земле и, как предполагается, играют решающую роль в круговороте питательных веществ в окружающей среде, продуктивности сельского хозяйства и здоровье человека.
Полный спектр ролей, которые фаги играют в регуляции активности и адаптации микробных сообществ, еще не выяснен. Фаги представляют собой один из крупнейших пулов генетического разнообразия с неизученной функциональной информацией. Например, большинство фаговых генов (от 70 до 80%), идентифицированных с помощью биоинформационного анализа, имеют неизвестную функцию и не обнаруживают соответствия с охарактеризованными генами. Подходы, основанные на гомологии и позволяющие связать фаговые гены с их функцией, ограничены недостатком экспериментальных данных. Хотя целенаправленный биохимический и генетический анализ являются золотым стандартом для оценки функций генов, большинство из этих методов не масштабируются на огромное количество вновь открываемых генов. Если мы не разработаем методы, позволяющие заполнить пробел в знаниях о генетическом разнообразии фагов и функциях генов, мы будем серьезно ограничены в понимании экологии фагов в различных микробиомах и использовании их в качестве инженерных антимикробных препаратов и редакторов микробных сообществ.
Исследователи из Национальной лаборатории имени Лоуренса Беркли (США) разработали схему быстрой маркировки генов бактериофагов. Они впервые продемонстрировали, что могут в масштабах всего генома определить гены фага, которые необходимы (или не необходимы) для заражения бактерий, а затем заменить несущественную ДНК отличительными штрих-кодовыми метками. Такие штрих-коды могли бы позволить исследователям и врачам быстро идентифицировать и отслеживать различные фаги в различных условиях, подобно тому, как штрих-коды продуктов используются в супермаркетах.
Для этого ученые использовали технологию CRISPR-интерференции (CRISPRi), чтобы подавить экспрессию почти всех генов двух модельных фагов. В результате подавления экспрессии было установлено, какие гены важны для инфекционного цикла каждого фага, а какие являются бесполезными. Затем исследователи смогли успешно сконструировать фаги со штрих-кодом, вставив отличительные ДНК-метки во вновь выявленные несущественные регионы.
"Значение этой работы огромно", - говорит Вивек Муталик, соавтор статьи в PLOS Biology, описывающей этот метод. "Этот отчет - первое исследование важности генов в таком масштабе у бактериальных вирусов. Мы используем технологию CRISPRi, чтобы отключить почти все гены у двух модельных фагов для картирования ландшафта существенности генов", - поясняет он. "Подавляя экспрессию каждого гена в масштабах всего генома, мы можем оценить, какие гены у этих двух фагов не важны, а какие - незаменимы для инфекционного цикла".
Хотя это может показаться нелогичным, рассказал Муталик, целью этой работы было найти несущественные гены в геномах фагов. И именно здесь на помощь приходит штрих-кодирование.
"Вопрос заключался в том, что если мы определим несущественный ген, то сможем ли мы заменить его каким-то идентификатором - уникальной меткой", - говорит Муталик. "Это как в продуктовом магазине, где на каждом товаре есть штрих-код. Представьте, что кто-то разбросал вещи по всему магазину. Для того, чтобы вернуть все назад надо использовать штрих-код. Штрих-коды помогают организовать и стандартизировать весь рабочий процесс. Например, для производства фаговых коктейлей".
"Допустим, я делаю фаговый коктейль - смесь фагов с уникальными штрих-кодами - для использования в каком-то приложении", - продолжает Муталик. "Но затем мы хотим проследить, как фаги работают. Для этого мы можем просто найти и отследить штрих-коды. Этот процесс поможет нам определить, какие фаги в данном фаговом коктейле работают, а какие нет. Представьте, что через пять дней мы обнаружим, что определенное лечение смесью фагов не работает и нуждается в некоторых изменениях. Тогда мы можем изменить фаговый коктейль, возможно, убрав один или два фага и добавив несколько более интересных фагов, которые будут лучше работать [в конкретной ситуации]. Использование штрих-кодированных фагов позволит сделать весь этот процесс гораздо более упорядоченным".
По словам Муталика, CRISPRi может помочь раскрыть целый ряд полезных биотехнологических приложений, таких как борьба с патогенами в сельском хозяйстве, восстановление окружающей среды, производство продуктов питания, генная терапия, разработка вакцин или избавление медицинских приборов от опасных биопленок. Информация о функциях генов бактериофагов подобна "океану знаний, к которому мы не знаем, как приступить", - говорит Муталик. "С одной стороны, есть неиспользованная информация о генах, а с другой стороны, есть область применения, например, резистентность к антибиотикам, где нам нужны срочные решения. Существует так много потенциальных применений фагов".
Однако, несмотря на свой потенциал, фаги остаются плохо охарактеризованными. Отчасти это связано с тем, что методы определения генов до сих пор были трудоемкими и специфичными для определенных типов фагов, а потому не могут быть полезными, учитывая огромную вселенную фагов. "Если мы хотим изучить геномную архитектуру сотен фагов, имеющих большое значение для различных приложений, нам необходимо усовершенствовать эти методы [определения характеристик]", - говорит Муталик. " У исследований фагов большое будущее".
