Кольцевые РНК распространены, загадочны и увлекательны, но их изучение требует большой осторожности.
За последние несколько десятилетий место РНК в биологии превратилось из простого промежуточного звена между ДНК и белком в увлекательную молекулу с разнообразными функциями, выходящими далеко за рамки простой транскрипции генетической информации. Многие из этих РНК складываются, как молекулярное оригами, но одна из их самых загадочных конфигураций - кольцевая: молекулы, в которых необычная версия стандартного процесса сплайсинга РНК складывает нить в обратную сторону, образуя петлю.
Когда-то считалось, что это результат неправильного сплайсинга, но теперь известно, что кольцевые РНК (circRNA) широко распространены на древе жизни. Они были обнаружены при раке, сердечно-сосудистых заболеваниях и болезни Альцгеймера и открывают захватывающие возможности как в качестве терапевтических агентов, так и в качестве биомаркеров. Тем не менее ученые до сих пор не могут понять, что делают эти молекулы. Некоторые из первых изученных circRNA зачищают малые некодирующие РНК, называемые микроРНК, чтобы предотвратить их связывание с мессенджерными РНК и снизить производства белка. Другие же могут взаимодействовать с различными белками или ферментом РНК-полимеразой, регулируя транскрипцию и экспрессию белков, или даже сами транслироваться. «О кольцевых РНК предстоит узнать очень много интересного», - говорит Николаус Раевский, системный биолог из Центра молекулярной медицины Макса Дельбрюка в Берлине.
«В значительной степени это терра инкогнита и это очень интересно».
Кольцевые РНК встречаются редко - по одним данным, они составляют около 0,1% последовательностей нерибосомальных РНК, - а также тем, что они практически идентичны линейным РНК, транскрибирующимся из той же части генома. Единственная их отличительная особенность - это место, где они соединяются вместе, образуя кольцо, то есть где конец одного сегмента РНК соединяется с более ранним сегментом в коде ДНК. Такое соединение называется обратным сплайсом (back-splice junction). Анализировать или генерировать чистые кольцевые формы без вмешательства линейных сложно, и специалисты предупреждают, что научная литература пестрит надуманными выводами, связывающими определенную кольцевую РНК с конкретной микроРНК без железных доказательств. «Необходимо сделать тысячу контролей», - подчеркивает Раевский.
Исследователи, которые только начинают работать в этой области, могут следовать уже опубликованным лучшим методикам. Но идеальный подход - проконсультироваться с ветеранами в области изучения circRNA перед началом проекта, советует Грейс Чен, биолог РНК из Медицинской школы Йельского университета. «Обращайтесь к нам пораньше и почаще», - говорит она. Тем не менее, исследователи адаптируют различные методы из стандартной биологии РНК для выявления и изучения этих интересных молекул и набор методов, предназначенных для работы с circRNA, постоянно растет. «Я думаю, что люди должны приложить усилия, чтобы попасть в эту область, если это то, что их интересует», - утверждает Чен. «Здесь есть много интересного».
Первый шаг - выявить интересующие нас circRNAs. Для этого существует множество баз данных, но многие из них не очищены, неполны и изобилуют непроверенными списками, предупреждает Джо Вандесомпеле, исследователь геномики рака из Гентского университета в Бельгии, который в 2020 году вместе со своими коллегами проанализировал базы данных circRNA. По его словам, система наименований - это джунгли, где одна и та же молекула имеет множество названий, а ландшафт базы данных - это настоящий кошмар. По его словам, если бы ему пришлось выбрать одну базу данных, то это был бы circAtlas от Пекинского института наук о жизни в Китае. Это потому, что circAtlas требует, чтобы все включенные в список circRNA были идентифицированы двумя методами, каждый из которых имеет по крайней мере две точки обратного сплайс-перехода.
Секвенирование - самый распространенный метод поиска новых кольцевых РНК, но эти петлеобразные молекулы часто отсутствуют в стандартных библиотеках РНК. Ученые обычно создают такие библиотеки, ориентируясь на поли(А)-хвост, прикрепленный к мРНК, - особенность, которой лишены кольцевые РНК. «Их нужно специально искать», - поясняет Джереми Вилуш, биолог РНК из Медицинского колледжа Бэйлора. Если говорить более конкретно, то охотники за кольцами должны отыскать тот самый back-splice junction. Это не одна сигнатурная последовательность, а любое место, где 3′-конец одной кодирующей последовательности, или экзона, соединяется с 5′-концом экзона, который обычно находится выше по течению в линейной последовательности - и некодирующие последовательности, называемые интронами, также могут участвовать в этом процессе.
Наиболее распространенным вариантом является создание библиотек совокупной РНК, говорит Вандесомпеле: это проще и дешевле, чем создание библиотек специфических circRNA, и означает, что ученые могут искать множество форм РНК, а не только кольца. Однако сначала нужно избавиться от рибосомальной РНК - структурного компонента рибосом, который представляет собой подавляющее большинство РНК в клетках. По наблюдениям Приски Оби, иммунобиолога из лаборатории Чена в Йельском университете, учитывая низкую численность большинства кольцевых РНК, получение достаточного количества материала для секвенирования является частью проблемы. Стоимость коммерческих наборов для выделения рибосомальной РНК быстро увеличилась бы, прежде чем ученые получили бы много circRNA. Поэтому Чен и ее коллеги разработали недорогой протокол по типу «сделай сам». Они добавляют ДНК-зонды, содержащие последовательности, соответствующие рибосомальной РНК, затем используют фермент РНКазу H для разрушения образовавшихся гибридных молекул РНК-ДНК. После нескольких дальнейших шагов по очистке «у вас должна получиться РНК, в которой в основном отсутствует рибосомальная РНК», - говорит Оби.
Альтернативный вариант - удалить большую часть некольцевых РНК. Для этого нужен фермент РНКаза R, который атакует линейные РНК на их концах. Но Вандесомпеле предупреждает, что необходимо тщательно подбирать условия реакции: слишком много фермента разрушит кольца, а слишком мало - пощадит часть линейных фрагментов. Кроме того, некоторые структуры РНК, такие как G-квадруплексы, гистоновые мРНК и малые ядерные РНК, могут помешать ферменту. Замена калия в реакционном буфере на литий дестабилизирует эти структуры и помогает улучшить деградацию линейных РНК, сообщают Вилуш и его коллеги.
После того как исследователи секвенировали РНК - методы короткого считывания обычно подходят, - следующим шагом будет поиск в этих последовательностях «сигнальных» бэк-сплайс-переходов. Но доступные для этого алгоритмы сильно различаются по чувствительности. В ходе проведенного Вандесомпелем и его коллегами в 2023 году сравнения 16 методов отдельные алгоритмы выявили от 1 372 до 58 032 кольцевых РНК из одной и той же клеточной линии. Вандесомпеле рекомендует исследователям выбрать как минимум два метода с низким уровнем ложноположительных результатов; его лаборатория остановилась на CirComPara2 и circtools, но у других специалистов могут быть другие требования. Ни один из этих алгоритмов не является идеальным. Неожиданные формы сращивания или проблемы с амплификацией могут приводить к ложным результатам.
Еще одна загвоздка заключается в том, что большинство алгоритмов поиска опираются на сопоставление последовательностей РНК с эталонным геномом, комментирует Джулия Зальцман, специалист по вычислительной биологии из Стэнфордского университета. Если последовательность circRNA отсутствует в эталонном геноме - скажем, вы ищете вирусную circRNA, а эталонная последовательность - человеческая, - она никогда не будет найдена, что приведет к ложноотрицательному результату. А поскольку близкие к гомологичным последовательности встречаются по всему геному, попытки сопоставить их также могут приводить к ложноположительным результатам.
Зальцман и ее коллеги разработали альтернативный подход под названием SPLASH2. Программа сравнивает два набора последовательностей, не опираясь на эталонный геном, на основе подсчета коротких генетических сегментов, называемых k-мерами. Зальцман рекомендует сравнивать образец, содержащий как кольцевые, так и линейные РНК, с образцом, обработанным РНКазой R для уменьшения линейного компонента - различия между этими двумя образцами укажут на кольцевые РНК. В одном из тестов на специфичность 92% потенциальных circRNA, выявленных с помощью SPLASH2, были известными или вероятными circRNA.
Для количественной оценки распознанных кольцевых РНК ученые могут использовать микрочипы, снабженные зондами нуклеиновых кислот для известных бэк-сплайс-переходов кольцевых РНК. Ученые могут промывать свои образцы на чипе, чтобы обнаружить, когда последовательность в образце совпадает с аналогичной последовательностью на массиве. Arraystar, биотехнологическая компания, специализирующаяся на некодирующих РНК, разработала микрочипы circRNA, нацеленные на известные кольцевые соединения для образцов человека, мышей и крыс. Исследователи использовали их, в частности, для выявления circRNA в стволовых клетках крови мыши, которая помогала клеткам избежать истощения. Главное предостережение: «Если ее нет на массиве, она может быть очень интересной, но вы никогда ее не найдете», - говорит Вилуш.
Янгу Ши, старший научный сотрудник компании Arraystar, отмечает, что около 70% предсказаний с помощью микрочипов оказываются верными. Поэтому следующим шагом для любого метода обнаружения является проверка наличия и подлинности кольцевых РНК - как правило, с помощью количественной ПЦР. Исследователи обрабатывают часть образца РНКазой R, чтобы разрушить линейные РНК, а часть оставляют необработанной и амплифицируют оба образца; любые настоящие кольцевые РНК должны выдержать ферментную обработку, в то время как линейные аналоги будут сокращены.
При этом бэк-сплайс-переход представляет собой лишь одну часть РНК: колец может быть несколько, каждый с разным набором экзонов или даже интронов, разделяющих один и тот же переход. Именно поэтому стратегия проверки Вилуша включает в себя подходы, не связанные с ПЦР, такие как Northern блоттинг, в котором исследователи разделяют молекулы РНК по размеру, а затем используют специфические для последовательности зонды для обнаружения интересующих молекул. Таким образом, можно не только обнаружить конкретные РНК, но и определить, сколько молекул разного размера содержат эти последовательности. Секвенирование с длинным прочтением, хотя и дорогостоящее, является еще одним вариантом. «Только в этом случае можно получить однозначную идентификацию», - считает Вандесомпеле.
По мнению Ванессы Конн, молекулярного биолога из Колледжа медицины и общественного здравоохранения Университета Флиндерса (Австралия), обилие circRNA может дать важный ключ к определению ее функции. Например, если ученые предсказывают, что circRNA зачищает микроРНК, то circRNA должна быть достаточно многочисленной, чтобы захватить большинство микроРНК в клетке. Но даже редкая circRNA может быть способна влиять на ген на уровне ДНК, поскольку в геноме есть только две ее копии. Например, Конн вместе со своим мужем Саймоном Конном, молекулярным биологом рака, возглавляющим лабораторию в Университете Флиндерса, обнаружила одну низкоуровневую кольцевую РНК, которая взаимодействует с ДНК, вызывая генетические транслокации, связанные с лейкемией.
По данным исследователей из Университета Флиндерса, количественное определение кольцевых РНК может оказаться непростой задачей. Это связано с тем, что малые circRNA в образце амплифицируются быстрее, чем большие, из-за чего маленькие молекулы кажутся более многочисленными, чем они есть на самом деле. Конн и его группа разработали метод, который они назвали SplintQuant, чтобы обойти эту проблему. После того как ученые определили интересующее их кольцо, они могут сконструировать ДНК-зонды, которые будут находиться по обе стороны от его бэк-сплайс-перехода. Затем с помощью фермента они соединяют все пары зондов, которые нашли кольцо, и используют количественную ПЦР для подсчета лигированных молекул. Но как же сравнить последовательности и количество circRNA в разных лабораториях и протоколах? Конны предлагают решение и здесь: синтетические circRNA, называемые SynCRS, которые исследователи могут добавлять в свои образцы перед созданием библиотеки. Использование известных количеств SynCRS позволяет ученым стандартизировать результаты в разных лабораториях.
После этого ученые могут перейти к самой интересной задаче - изучению функций. Основные подходы включают нокаут или сверхэкспрессию колец и снова сходство с другими видами РНК запутывает ситуацию. По утверждению Гильермо Акино-Жаркина, исследователя из Детской больницы имени Федерико Гомеса в Мехико, метод, называемый РНК-интерференцией, является одним из распространенных подходов, поскольку его можно направить на соединение обратных сплайсов. Например, воздействуя на ассоциированную с раком кольцевую РНК circAGO2 у мышей, исследователи продемонстрировали роль этого гена в стимулировании образования и агрессивности опухолей. Кроме того, если исследователи подозревают, что определенные последовательности кольцевых РНК имеют партнеров по связыванию среди нуклеиновых кислот или белков в клетке, они могут сконструировать интерферирующие РНК, которые будут связываться с этими участками и подавлять их.
Альтернативный вариант - использование системы CRISPR-Cas для нацеливания и уничтожения интересующих колец. С помощью Cas9, фермента, нацеливающегося на ДНК, исследователи могут повредить сам ген кольцевой РНК, уничтожив его способность производить молекулы. Раевский и его коллеги использовали эту стратегию, чтобы создать мышей с недостатком кольцевой РНК Cdr1as, которая взаимодействует с микроРНК miR-7. Без Cdr1as клетки содержали меньше miR-7, что позволяет предположить, что кольцевая РНК контролирует стабильность микроРНК или, возможно, ее транспорт.
При этом на производство линейной РНК также могут влиять изменения в геноме. В качестве альтернативы исследователи могут использовать фермент Cas13, чтобы нацелиться на бэк-сплайс-переход или другие сайты связывания на уровне РНК. «Вы блокируете кольцевую РНК, но не трогаете геном», - объясняет Акино-Жаркин. По его оценкам, эффективность нокдаунов такого типа составляет около 80-90% по сравнению с 50-60% эффективности РНК-интерференции. Cas-ферменты, однако, могут создавать и нецелевые эффекты.
Таким образом, как и в случае с кольцевыми РНК, валидация и контроль остаются ключевыми, говорит Вилуш. Например, исследователи, считающие, что кольцевая РНК может перехватывать микроРНК, могут удалить саму кольцевую РНК, а также мутировать вероятные сайты связывания микроРНК и посмотреть на аналогичные результаты. И если устранение кольца приводит к появлению фенотипа, то добавление кольца обратно должно его изменить. Вот тут-то и приходит на помощь сверхэкспрессия. Это возможно, но невозможно достичь совершенства, полагает Раевский. «Насколько я знаю, никто не может создать на 100% чистую кольцевую РНК», - говорит он. «Вы также будете иметь некоторые другие РНК».
Исследователи могут генерировать кольцевые РНК синтетическим путем или делать их in vivo с помощью плазмид, которые предназначены для использования собственного механизма сплайсинга клетки. Последний подход «в идеале должен наиболее точно повторять работу клетки, которая ее производит», - говорит Оби. Один из классических подходов, стратегия перестановки интрон-экзонов, предполагает перестановку экзонов и интронов в конфигурации, способствующие автоматическому выделению кольцевого продукта. Плазмиды, генерирующие circRNA, доступны в американском некоммерческом хранилище плазмид Addgene.
По словам Оби, для наилучшего контроля чистоты circRNA предпочтительнее использовать синтетические лабораторные методы. Она и Чен предпочитают генерировать линейные предшественники РНК, а затем соединять их вместе с помощью фермента лигазы. Чтобы свести к минимуму нежелательные побочные продукты, исследователи могут добавить РНКазу R для разрушения нежелательных линейных РНК и использовать такие методы разделения, как гель-электрофорез или жидкостная хроматография, для очистки нужных видов. Но, как всегда, предупреждает Раевский, есть и предостережения. При использовании синтетических колец «все, что вы вводите, является искусственным и может не иметь никакого отношения к биологии, происходящей в клетках».
Поэтому, по его словам, когда речь идет о кольцевых РНК, важно проверять гипотезы с помощью нескольких методов. Например, Раевский и его коллеги недавно сообщили, что кольцевая РНК Cdr1as взаимодействует с miR-7, регулируя выделение нейромедиатора глутамата из нейронов. Они использовали целый ряд методов: культуру первичных нейронов млекопитающих, химическую и электрическую стимуляцию, визуализацию РНК одной клетки и нокауты микроРНК - и это только некоторые из них.
Является ли это излишеством? Нет, когда речь идет о кольцевых РНК, подчеркивает Раевский. «Необходимо наконец сказать что-то значительное об этих сумасшедших молекулах».
