В 1890-х годах врач Уильям Коули начал вводить пациентам с раковыми заболеваниями бактерии, узнав о пациентах, у которых наблюдалась спонтанная регрессия опухоли после одновременной бактериальной инфекции.
Он был одним из первых ученых, связавших активацию иммунной системы с противоопухолевым ответом, за что получил титул "отца иммунотерапии". Несмотря на некоторые успехи в клинике, проблемы безопасности и развитие радиотерапии привели к тому, что эти бактериальные эликсиры, получившие название "токсины Коули", отошли на второй план.
За последние несколько десятилетий прогресс в иммунологии, микробиологии и синтетической биологии возродил интерес к биоинженерии бактерий для лечения рака. В работе, опубликованной в журнале Science, исследователи разработали пробиотики, которые колонизируют опухоли и направляют сконструированные Т-клетки к раковой опухоли. Их новая платформа не только показывает, что сконструированные бактерии могут помочь существующим иммунотерапиям получить доступ к трудноизлечимым солидным опухолям, но и подчеркивает более широкий потенциал "живых" лекарств.
Микросреда опухоли - негостеприимная экосистема. "Бактериям все это безразлично. Они действительно, в самом общем смысле, ищут место, где они могут выжить в организме, вдали от иммунной системы", - поясняет Тал Данино, биолог-синтетик из Колумбийского университета и соавтор исследования.
Гипоксическое, минимально контролируемое ядро твердой опухоли - идеальное место для бактерий. Однако некоторые штаммы бактерий могут заселять здоровые органы, поэтому исследователям необходимо изучить способы модификации бактериального генома для снижения вирулентности и токсичности. Хотя аттенуированные бактерии оказались более безопасными как для мышей, так и для людей, исследователи отмечали слабую колонизацию опухоли и отсутствие ее регрессии. Теперь, чтобы улучшить таргетность и специфичность воздействия на опухоли, исследователи ищут решения в области синтетической биологии.
Во время учебы в аспирантуре Данино создал крошечные генетические цепочки в бактериях, которые запускают синхронизированный лизис, как только бактерии достигают порога плотности популяции, или кворума, при котором они высвобождают генетически закодированный груз. Горстка бактерий лопается, запустив следующий цикл роста, кворума и лизиса. "Это несовершенная система, и в этом ее прелесть", - отмечает Роза Винсент, аспирантка из группы Данино и соавтор статьи. "Это циклический механизм доставки". Данино заинтересовало использование этой осциллирующей генной цепочки для решения биомедицинских проблем, и поэтому он переключился на бактериальную терапию рака. Бактерии уже имеют склонность к опухолевому микроокружению, поэтому он сосредоточился на инженерии бактерий для доставки диагностического или терапевтического средства внутрь опухоли, подобно троянскому коню.
"Идея использовать бактерии для маркировки конкретного места - очень перспективна и позволяет преодолеть проблему гетерогенности антигенов", - считает Рохелио Эрнандес-Лопес, биоинженер из Стэнфордского университета, который не принимал участия в исследовании. Одна из причин, по которой солидные опухоли трудно поддаются лечению с помощью успешных в других случаях антиген-направленных терапий, таких как химерные антигенные рецепторы (CAR) Т-клеток, заключается в том, что очень немногие антигены, обнаруженные на поверхности опухолей, специфичны для раковых клеток. Кроме того, опухоль-ассоциированные антигены неоднородны у разных пациентов, а раковые клетки могут мутировать, чтобы избежать целевой терапии, что заставляет врачей охотиться за движущейся мишенью.
"Мне стало интересно, как мы можем создать хорошие CAR для солидных опухолей, если нет хорошей мишени", - рассказывает Винсент, которая ранее работала над логически управляемыми подходами к нацеливанию CAR T-клеток на солидные опухоли. Это любопытство привело ее к работе Данино над созданием бактерий для лечения рака.
В качестве троянского коня исследователи создали пробиотический штамм Escherichia coli Nissle 1917, который был оснащен системой кворум сенсингово лизиса, разработанной Данино. Как только бактерии достигали кворума, они выделяли синтетические антигены, которые приклеивались к опухоли. В частности, исследователи соединили зеленый флуоресцентный белок (GFP) с гепарин-связывающим доменом (HBD) белка плацентарного фактора роста. Липкий HBD прикреплялся к коллагенам и полисахаридам - вездесущим компонентам опухолевой среды, таким образом устанавливая флажки GFP на опухоли. Хотя эти молекулы встречаются и в здоровых тканях, в опухоли их очень много. "Мы полностью полагаемся на то, что бактерии специфичны для этих опухолей", - отмечает Винсент.
Большинство одобренных FDA США CAR T-клеточных терапий нацелены на опухолевый антиген кластера дифференцировки 19 (CD19), но Винсент разработала свои CAR, чтобы нацелить их на синтетический антиген GFP. "Мы окрашиваем опухоли в зеленый цвет, и Т-клетки распознают его", - говорит Винсент. "Прелесть CAR в том, что они модульные, и вы можете просто поменять антигенсвязывающий домен на любой другой", - добавляет она. Протестировав свою пробиотическую CAR-систему in vitro на различных линиях раковых клеток человека, исследователи отметили повышенную специфичность и цитотоксичность по сравнению с системами, не содержащими ни GFP-метки, ни рецепторов. После проверки in vitro их система была готова покинуть гараж и отправиться в путь.
Испытание пробиотической CAR-модели на практике
Для первого испытания своей пробиотической CAR-платформы в естественных условиях исследователи использовали иммунодефицитных мышей с подкожными опухолями, созданными из раковых клеток человека. Введя сконструированные бактерии непосредственно в опухоль, они подождали 48 часов, чтобы кворум-регулируемое высвобождение меток GFP стало возможным, прежде чем аналогичным образом доставить сконструированный CAR. Сконструированная пробиотическая система CAR подавила рост опухоли, а последующие анализы опухолей с помощью проточной цитометрии показали усиление активации Т-клеток.
Исследователи также обнаружили, что неполная система дает неполный ответ: пустые бактерии, введенные вместе с разработанным CAR, все равно вызывали некоторую активацию Т-клеток в месте опухоли. "Мне больше всего нравится то, что Т-клетки очень сильно реагируют на бактерии", - говорит Винсент. "Это делает их действительно желанным партнером. Да, они могут выделять полезную нагрузку, но они также являются естественными стимуляторами, поэтому они делают более холодную опухоль более горячей". Чтобы увеличить пролиферацию и персистенцию CAR T-клеток, пациенты должны сначала пройти процедуру лимфодеплеции, чтобы уничтожить циркулирующие T-клетки. Однако долгосрочная цель иммунотерапии заключается в том, чтобы лечение проводилось при неповрежденной иммунной системе.
"Нам понадобится помощь эндогенной иммунной системы, вместо того чтобы полагаться на один антиген, чтобы очистить всю опухоль", - говорит Винсент.
Чтобы проверить свою систему на функционирующей иммунной системе, Винсент и ее коллеги имплантировали опухоли на обе задние конечности иммунокомпетентных мышей, а затем ввели сконструированные бактерии непосредственно в один из участков опухоли, после чего через несколько дней провели два раунда лечения CAR T. Исследователи надеялись, что их система сможет вызвать достаточное воспаление, чтобы стимулировать иммунную систему хозяина распознать дополнительную опухоль, поэтому они были рады обнаружить снижение роста опухоли не только в обработанном, но и в необработанном участке.
Подкожные эксперименты позволили подготовиться к большому эксперименту: внутривенному введению пробиотической системы CAR. Для этого они имплантировали раковые клетки человека в жировые подушечки молочной железы мышей с ослабленной иммунной системой, а затем ввели пробиотическую CAR-систему с небольшими изменениями. Для того чтобы еще больше привлечь CAR T-клетки к месту опухоли, исследователи сконструировали бактерии таким образом, чтобы они выделяли привлекающий иммунные клетки человеческий хемокиновый лиганд 16 (CXCL16). Это создало градиент концентрации для CAR T-клеток, чтобы они направлялись к опухоли. Добавленный хемокиновый груз придал системе дополнительный импульс, превзойдя стандартную пробиотическую схему CAR в отношении ингибирования роста опухоли. Кроме того, анализ других органов показал, что экспрессия бактерий и GFP ограничена местом опухоли.
Прежде чем перенести эти эксперименты на человека, исследователям сначала нужно будет генетически ослабить сконструированные бактерии. В данном исследовании они использовали штамм E coli дикого типа, но мыши менее чувствительны к токсичности грамотрицательных бактерий, чем люди. "Сейчас основное внимание лаборатории сосредоточено на создании трансляционного штамма бактерий", - рассказала Винсент.
"Это пример того, как две разные инженерные системы могут дополнять друг друга и выполнять синергетические функции", - говорит Эрнандес-Лопес. "Данино разрабатывал схему лизиса бактерий в течение многих лет, и очень здорово, что теперь она сочетается с другими подходами".
Когда Данино видит бактерии, он видит универсальную платформу, которая может доставлять терапевтические препараты в опухоли, а также взаимодействовать с другими методами. Помимо изменения опухолевой среды для повышения эффективности CAR T, исследователи изучают, как сконструированные бактерии могут улучшить позитронно-эмиссионную томографию, магнитно-резонансную томографию, фокусировать ультразвук и даже доставлять наночастицы с лекарственными препаратами. "Что нас действительно радует, так это создание платформы, которую другие люди могли бы использовать для доставки своих полезных веществ или взаимодействия с другими видами разрабатываемых ими методов лечения рака", - говорит Данино.
"Область инженерии микробиома постепенно сближается с областью инженерии Т-клеток, и будет интересно посмотреть, что будет дальше", - отмечает Эрнандес-Лопес.
