Вирус COVID-19 in vitro быстро эволюционирует к более высокой инфекционности, что может быть шагом к снижению вирулентности.Вирус COVID-19 in vitro быстро эволюционирует к более высокой инфекционности, что может быть шагом к снижению вирулентности.
Повышенная инфекционность коррелирует с мутациями, которые увеличивают связывание вируса с глюкозаминогликаном клеточной поверхности, гепарансульфатом.
Вирусы накапливают мутации в процессе репликации в инфицированных клетках. Повторная репликация может привести к появлению вирусных штаммов с ослабленной вирулентностью. Такие штаммы могут использоваться для создания вакцин, если ослабленный вирус способен вызвать иммунитет без серьезных осложнений.
Этот подход не нов. Альберт Сэбин разработал аттенуированную полиовирусную вакцину в середине 20-го века, которая помогла искоренить полиомиелит в Западном полушарии. Аттенуированные вирусные вакцины против краснухи, кори, желтой лихорадки и других заболеваний широко используются. Можно ли разработать аналогичную вакцину против COVID-19?
Исследователи из Университета Алабамы в Бирмингеме опубликовали в журнале Journal of Virology результаты фундаментального исследования, подтверждающего такую возможность. Они задались простым вопросом: какие мутации преобладают, когда SARS-CoV-2 выращивается в культуре ткани в последовательных генерациях, которые вирусологи называют пассажами?
Исследователи обнаружили, что изоляты SARS-CoV-2 быстро адаптировались в процессе многократного выращивания в клетках Vero E6 - штамме клеток почек, который обычно используется для размножения вирусов. Эволюционировавшие вирусы приобрели более высокую инфекционность, продемонстрировали более быстрое распространение инфекции и образовали значительно более крупные бляшки на клетках Vero. Бляшка - это видимый фрагмент клеточного слоя, где клетки разрушаются в результате размножения и высвобождения вируса.
Для одного из штаммов SARS-CoV-2, протестированных исследователями - штамма из штата Вашингтон, который был первым вирусом COVID-19, обнаруженным в США в начале 2020 года - среднее количество инфекционных вирусных частиц, высвобожденных из клеток, было в 100 раз меньше, чем количество инфекционных частиц, высвобожденных после четырех пассажей.
Исследователи под руководством Ильи Фролова, профессора кафедры микробиологии UAB, обнаружили, что эволюция вируса развивалась по двум основным механизмам. Первый - вставка семи аминокислот, включая две положительно заряженные аминокислоты, в белок шипа вашингтонского изолята SARS-CoV-2. Поскольку вирус использует свои шипы для присоединения к рецепторам ACE2 на клетках, что запускает его проникновение в клетку, протеин спайка является основным фактором, определяющим патогенез.
Второй механизм заключался в изменении одной аминокислоты с серина на глицин - мутация под названием S686G - в белке спайка вблизи места его расщепления. Оба механизма увеличили способность мутанта связываться с гепарансульфатом, который в изобилии присутствует на поверхности клеток. Эти два изменения также увеличивали размер бляшек и скорость распространения инфекции. Это связывание с гепарансульфатом на клеточной мембране, по-видимому, является механизмом первичного прикрепления вируса до высокоаффинного взаимодействия шипа с клеточным рецептором ACE2. В качестве проверки биологической значимости растворы гепарина - родственного полисахарида - подавляли инфекционность мутантных вирусов, демонстрирующих повышенное связывание с гепарансульфатом, в то время как гепарин не снижал инфекционность немутантных вирусов.
Чтобы проверить независимое действие двух основных механизмов, исследователи клонировали каждое изменение в ДНК, которая была копией генома первого изолята SARS-CoV-2 из Ухани (Китай), секвенированного в январе 2020 года. Копии РНК, полученные из этих ДНК-конструкций, были внесены в клетки, и клетки затем произвели вирус. Исследователи обнаружили, что каждый отдельный механизм увеличивал связывание конструкций с гепарансульфатом, а двойная мутантная конструкция с обоими изменениями имела значительно более высокую скорость инфицирования, чем любой из одиночных мутантов.
"Важной особенностью двойного мутанта является то, что его дальнейшая эволюция в культивируемых клетках представляется маловероятной", - отмечает Фролов. По его словам, рекомбинантные одиночные мутанты продолжали накапливать различные мутации в дальнейших пассажах, в то время как двойной мутант, содержащий и аминокислотную вставку, и S686G, был стабилен и не приобретал дополнительных изменений.
Интересно, что SARS-CoV-2 является коронавирусом с положительной цепью РНК (+ssRNA вирусы). Альфавирусы также являются вирусами с положительной РНК. Другие исследователи показали, что альфавирусы чикунгунья, венесуэльского лошадиного энцефалита, Росс Ривер и Синдбис демонстрируют аналогичную быструю эволюцию во время роста в культуре клеток, включая увеличение размера бляшек, более сильное взаимодействие с гепарансульфатом и стимулирование распространения инфекции.
Важно отметить, что эти эволюционировавшие альфавирусы обычно были значительно менее патогенными для мышей и людей.
"Как и гепарансульфат-связывающие мутанты других РНК+ вирусов, эволюционировавшие SARS-CoV-2 также могут быть аттенуированы in vivo, особенно двойной мутант, демонстрирующий наиболее адаптированный фенотип", - отмечает Фролов.
"Таким образом, они также могут быть использованы в качестве основы для разработки стабильных живых аттенуированных вакцин против COVID-19".
