Новости

Методы секвенирования следующего поколения (NGS) начали упоминаться в литературе в середине 2000-х годов и оказали трансформирующее влияние на наше понимание микробной геномики и инфекционных заболеваний. Тем не менее, существуют многочисленные споры о том, как, когда и где секвенирование следующего поколения будет играть роль в клинической микробиологической лаборатории. Что такое метагеномное секвенирование следующего поколения?    Секвенирование следующего поколения - это любой из нескольких высокопроизводительных методов секвенирования, с помощью которых можно одновременно и независимо секвенировать миллиарды фрагментов нуклеиновых кислот. Этот метод отличается от классических методов, таких как секвенирование по Сэнгеру (также известное как секвенирование с дидезоксинуклеотидной терминацией цепи), которое обрабатывает одну нуклеотидную последовательность за реакцию.    Например, чтобы охарактеризовать бактериальный геном с помощью NGS, геном разделяется на множество фрагментов, которые дают последовательности или чтения длиной от сотен до десятков тысяч оснований. Эти последовательности собираются в единый геном с помощью вычислительных методов. Несколько перекрывающихся чтений последовательности собираются вместе, чтобы получить одну более длинную последовательность, называемую контигом. Между контигами часто остаются пробелы, и хотя идеальным методом секвенирования были бы высокоточные длинные чтения последовательностей, платформы, производящие более короткие чтения, обычно менее дорогостоящие, а перекрытие последовательностей делает их более точными. Сконструированный геном (вероятно, содержащий пробелы) выравнивается по эталонной базе данных для идентификации организма. Эта технология представляет собой значительный прогресс по сравнению с первыми разработками секвенирования, когда реализация проекта по созданию генома одной бактерии могла занять несколько лет.    Метагеномное NGS (mNGS) - это секвенирование всех нуклеиновых кислот в образце, который может содержать смешанные популяции микроорганизмов, и приведение их в соответствие с эталонными геномами, чтобы понять, какие микроорганизмы присутствуют и в каких пропорциях. Возможность последовательности и идентификации нуклеиновых кислот из множества различных таксонов для метагеномного анализа делает его новой мощной платформой, которая может одновременно идентифицировать генетический материал из совершенно разных царств организмов.    Возможные клинические применения огромны, включая диагностику инфекционных заболеваний, отслеживание вспышек, инфекционный контроль, обнаружение мутаций и патогенов, и многие другие. mNGS, иногда называемый дробовым (shotgun) секвенированием, применялся для клинических образцов различных типов, включая спинномозговую жидкость, кровь, образцы дыхательных путей, желудочно-кишечную жидкость и глазное отделяемое. Каковы преимущества метагеномного секвенирования следующего поколения?    Самая большая ценность mNGS заключается в том, что это беспристрастный метод диагностики без гипотез, в отличие от разновидностей ПЦР, которые полагаются на праймеры для идентификации конкретных мишеней, подлежащих амплификации и обнаружению. Даже универсальные или широкодиапазонные методы ПЦР не являются достаточно широкими, чтобы считаться метагеномными, поскольку они используют специфические праймеры консервативных последовательностей гена 16S рибосомальной РНК (рРНК) и внутреннего транскрибируемого спейсера (ITS) для амплификации характерных последовательностей нуклеиновых кислот, которые могут быть биоинформационно классифицированы как бактерии/археи или грибы соответственно.    Универсальные праймеры также представляют собой проблему при диагностике полимикробных инфекций с помощью молекулярных тестов. При наличии полимикробных популяций при использовании 16S секвенирования на каждый нуклеотид будет приходиться несколько base-calls, что приводит к получению смешанной нуклеотидной хроматограммы, которую невозможно интерпретировать. Хотя существуют деконволюционные вычислительные методы для предсказания идентифицированных организмов, они не являются стандартными для многих лабораторий, которые часто переходят к секвенированию гена 16S следующего поколения для полимикробных образцов. Каковы проблемы метагеномного секвенирования следующего поколения?    Несмотря на потенциал mNGS, существует множество препятствий, которые необходимо преодолеть, прежде чем эта технология станет частью обычной лаборатории, а также пробелы в нашем понимании ее диагностической пользы. К основным препятствиям относятся интерпретация результатов (различение контаминации и колонизации от истинных патогенов), выбор и валидация баз данных, используемых для анализа, и прогнозирование (или отсутствие такового) чувствительности к противомикробным препаратам.     Распространено мнение, что mNGS настолько невероятно чувствительно, что оно выявляет диагноз, когда все другие тесты отрицательны. Хотя в некоторых случаях mNGS может быть аналитически более чувствительно, чем стандартные методы культивирования, необходимое удаление огромного количества нуклеиновой кислоты человека во время подготовки секвенирования и (с помощью вычислительных методов) во время постаналитического процесса, что может снизить чувствительность по сравнению с целевыми методами ПЦР для многих организмов.    Специфичность mNGS также является проблемой. Контаминация образцов во время сбора образцов вызывает большую озабоченность, учитывая повышенную аналитическую чувствительность mNGS по сравнению со стандартными культуральными методами, и необходим валидированный процесс контроля качества на всех этапах - от оценки чистоты реагентов до измерения адекватного контроля покрытия генома.     Кроме того, на некоторых платформах Illumina могут быть указаны неправильные индексы штрих-кодов, что приводит к ложноположительным результатам данных секвенирования. Биоинформационный контроль качества необходим для обеспечения высокого качества и валидированных геномов с минимальными ошибками в базе данных, и в идеале должен присутствовать персонал с опытом биоинформатики для интерпретации результатов секвенирования для каждого теста, чего нет в большинстве клинических микробиологических лабораторий.    Более важным остается вопрос о клинической специфичности mNGS: являются ли обнаруженные последовательности патогенами, вызывающими текущее заболевание пациента? Аналитическая специфичность тестирования mNGS может быть решена с помощью строгого контроля на всех этапах сбора образцов, подготовки библиотеки секвенирования, проведения анализа и биоинформационной классификации, но клиническая специфичность не решается напрямую с помощью этих подходов.     Вопросы, которые могут помочь определить клиническую целесообразность и применимость, включают:     Как отличить организмы, связанные с транзиторной бактериемией, от флоры полости рта/желудочно-кишечного тракта или колонизаторов кожи при тестировании mNGS крови/плазмы?    Как следует указывать глубину секвенирования и насколько достоверна связь глубины секвенирования с истинной инфекцией?    Различается ли эта связь в зависимости от патогена/хозяина?    Какова ожидаемая продолжительность периода полураспада патогена, выявляемого с помощью mNGS, после того как пациент получает соответствующую терапию?    Несмотря на неоспоримые возможности этой технологии с точки зрения исследований и открытий, крайне необходимы исследования клинической целесообразности и экономической эффективности.    Стоит также отметить, что в настоящее время не существует сертифицированных тестов mNGS, которые можно было бы использовать для исследования микроорганизмов. На сегодняшний день лишь несколько диагностических NGS-систем получили разрешение FDA, например, для проведения онкологических исследований или выявления муковисцидоза.    В целом, несмотря на то, что тестирование mNGS может сыграть важную роль в микробиологической диагностике в будущем, особенно по мере развития возможностей секвенирования и биоинформационных технологий, этот метод остается технологией высокой сложности, клиническое применение которой в современной медицинской практике остается неопределенным. Хотя в ближайшем будущем тестирование с помощью mNGS может предложить новые и захватывающие клинические диагностические возможности ничто из этого не заменит в ближайшее время проницательного бактериолога.

Микробиота не случайна", - говорит Мартин Блейзер, директор Центра передовых биотехнологий и медицины Ратгерского университета и автор книги "Пропавшие микробы". "Микробиота эволюционировала вместе с нами в течение очень долгого времени, и она выполняет полезные функции для нас, так же как и мы выполняем полезные функции для нее... Мы все вместе работаем как экологическая система". С тех пор как наш вид - и вся жизнь - существует на Земле, мы находимся в компании микробов: они обитают в нашем кишечнике, на нашей коже и в окружающей среде, в которой мы живем. Временами эти микроорганизмы становились оппортунистическими патогенами, пользуясь уязвимостью отдельных людей и популяций, но чаще они были нашими старейшими эволюционными друзьями. Проблема в том, что микробиота в том виде, в котором мы ее знали, исчезает.    Почему исчезают микроорганизмы? Одним из популярных объяснений является гигиеническая гипотеза, которая предполагает, что люди не сталкиваются с достаточным количеством микробных стимулов в раннем возрасте. Блейзер предполагает, что вместо одной лишь гигиенической гипотезы более подходящей может быть гипотеза о том, что сами микробы истощаются из поколения в поколение в результате ряда современных практик, которые нарушают наши исконные отношения с ними. Вместо активных охотников-собирателей, питающихся большим количеством клетчатки и находящихся в тесном контакте друг с другом и окружающей средой, как наши предки, современные люди ведут все более оседлый городской образ жизни, который включает в себя переработанные пищевые продукты, воздействие антибиотиков и факторы образа жизни, значительно отличающиеся от наших эволюционных истоков.    Такая практика, ограничивающая разнообразие микробиома, приводит к потере вертикальной передачи, поскольку каждое последующее поколение имеет меньше видов организмов для передачи следующему. Блейзер и другие авторы предположили, что именно эта фундаментальная потеря микробов, особенно в раннем возрасте, стоит за стремительным ростом распространенности неинфекционных заболеваний в XX и XXI веках.    С момента зачатия наше развитие, вероятно, происходит под влиянием микробных симбионтов. Существует ли уникальная плацентарная микробиота, активно изучается, но одно исследование на животных показало, что даже кратковременное внутриутробное воздействие материнских микроорганизмов может перепрограммировать и усилить неонатальный иммунный ответ. Новорожденные впервые знакомятся с микробиотой при рождении, когда они купаются в богатом лактобактериями микробном сообществе родового канала, которое в конечном итоге закладывает микробиоту их кишечника.     Неперевариваемые олигосахариды в грудном молоке укрепляют и отбирают симбиотические виды микробов, в то время как микробы переваривают гликаны для новорожденных и участвуют в важнейшей подготовке иммунной системы. По мере того, как младенцы исследуют (и пробуют на вкус) окружающую среду, а также по мере введения твердой пищи, микробиота созревает и формирует пожизненный коммуникационный интерфейс на слизистых оболочках тела.    Итак, микробиота это: Влияние на метаболическую функциюЗащита от оппортунистической инфекции.Расщепление неперевариваемых для человека соединенийИзменение экспрессии геновВзаимодействие с иммунной системойВыработка нейротрансмиттеров, которые влияют на неврологическую функцию и поведение    Сравнение с микробиотой кишечника представителей культур, в большей степени соответствующей образу жизни предков, таких как жители Амазонки, Малави, Танзании и Папуа-Новой Гвинеи, постоянно демонстрирует более богатое разнообразие микробов по сравнению с западными обществами. В частности, в обществах с более традиционным укладом жизни наблюдается более высокое обилие видов, ферментирующих клетчатку, таких как Prevotella, и значительные функциональные различия в метаболическом потенциале микробиоты кишечника. Общества охотников-собирателей и земледельцев демонстрируют некоторые композиционные различия между собой, но вместе они более схожи и более богаты видами, чем у современных горожан. Это говорит о том, что западные цивилизации значительно отличаются от микробиоты, с которой мы коэволюционировали, как за счет изменения состава, так и за счет изменения количества присутствующих видов.    Хотя современные методы, такие как перинатальное применение антибиотиков, кесарево сечение и кормление молочными смесями, часто необходимы по медицинским показаниям, все они влияют на ту уязвимую фазу, в течение которой происходит формирование иммунологических и метаболических моделей. "Существует траектория развития, которая задается в первые пару лет жизни", - объясняет Блейзер. "Именно в это время происходит передача [микробиоты] из поколения в поколение. Это происходило на протяжении миллионов лет. Мы препятствуем этому".     Все больше данных свидетельствуют о том, что эффект антибиотикотерапии важен на любом этапе жизни, но особенно драматичен в раннем возрасте. Например, дети, получающие антибиотики в первые 2 года жизни, впоследствии подвергаются значительно более высокому риску развития аллергии, астмы, ожирения и воспалительных заболеваний кишечника. Хотя часто антибиотики являются спасительным средством, сегодня мы понимаем, что после лечения антибиотиками микробиота может не вернуться к нормальной активности, и никогда полностью не восстановиться.    Современный рацион питания также оказывает решающее влияние на микробиоту. "Западные" диеты с высоким содержанием насыщенных жиров, рафинированных углеводов и сахара и низким содержанием свежих продуктов и клетчатки связаны с уменьшением сложности микроорганизмов, дисбалансом экосистемы кишечника и заболеваниями. Частично эта потеря может быть вызвана конкуренцией за питательные вещества, потерей неперевариваемой массы, попадающей в толстую кишку, где живут самые богатые сообщества бактерий, изменениями воспалительной среды на стыке хозяин-микроб и другими изменениями окружающей среды, такими как pH.    Каждое из этих изменений постепенно выводит микробы, приспособленные к выживанию на богатой питательными веществами пище в стабильной среде обитания хозяина. Исследования на животных показали, что такое "вымирание, вызванное питанием", может серьезно ограничить разнообразие микробиоты все более агрессивными способами на протяжении нескольких поколений. Потери не проходят бесследно. В течение одного поколения иммигранты из стран с низким уровнем риска в западные общества достигают того же риска, что и жители Запада, в отношении хронических заболеваний, связанных с микробиотой, таких как воспалительные заболевания кишечника.    Как мы можем восстановить разнообразие микробиома? Во-первых, необходимо как можно скорее обуздать чрезмерное назначение и злоупотребление антибиотиками. Правительства должны контролировать и ограничивать безрецептурную продажу антибиотиков и просвещать население и медицинских работников о важности рационального использования антибиотиков. В свете современных исследований, антибиотикотерапия в раннем возрасте должна быть особенно взвешенной с учетом растущих доказательств долгосрочных рисков для маленьких детей. Медицинские организации должны критически пересмотреть стандарты лечения, которые могут способствовать ненужным курсам антибиотиков, особенно у новорожденных.    Мы также можем сместить акцент в лечении на антибиотики узкого спектра действия, которые правильно воздействуют на инфекцию, оставляя остальную микробиоту невредимой. Если раньше антибиотики хвалили за широту спектра действия, то, возможно, антибиотики будущего будут цениться за их специфичность. Ожидание идентификации конкретной бактерии для лечения узкого спектра действия может быть сложным в условиях стационара, где не всегда есть время дождаться получения полного результата посева, но эта дилемма подчеркивает необходимость быстрой клинической микробиологической диагностики.    Также может помочь изменение медицинской практики, не связанной с применением антибиотиков. В случае кесарева сечения ВОЗ согласна с тем, что оно должно быть ограничено медицинской необходимостью. В случае, если кесарево сечение необходимо, новорожденных потенциально можно "засеять" флорой влагалища матери, чтобы имитировать естественное воздействие микробиоты. Первые данные свидетельствуют о том, что этот метод может частично сгладить потерю микроорганизмов при кесаревом сечении. Поддержка и обеспечение безопасных условий для продолжения грудного вскармливания для молодых матерей также является важным способом повышения уровня грудного вскармливания. Грудное молоко остается ключевым фактором укрепления микробиоты младенца и развивающейся иммунной системы.    Мы также должны учитывать выбор образа жизни. Жизненно важное значение клетчатки и ее заметное отсутствие в современном питании невозможно переоценить. Клетчатка действует как "пребиотик", который усиливает популяции полезных микробов. Одновременно она метаболизируется ими в короткоцепочечные жирные кислоты, что многократно увеличивает пользу для здоровья. Свежие фрукты и овощи содержат разнообразные виды пищевых волокон, которые способствуют микробному разнообразию, однако только около 5% горожан потребляют рекомендуемые 19-38 г в день.     Пробиотики, напротив, представляют собой живые организмы, употребляемые в добавках или продуктах питания, таких как йогурт, и являются популярными продуктами для здоровья. Несмотря на то, что они продемонстрировали целый ряд полезных свойств, клинические доказательства того, что они способны изменять состав микробиоты у здоровых людей, немногочисленны. Тем не менее, наряду с пребиотиками, они могут быть частью здорового питания. Физические упражнения также улучшают разнообразие микробиоты кишечника и должны рассматриваться как часть любого здорового образа жизни.    Возможно, удастся восстановить некоторые таксоны микроорганизмов, которые исчезли из микробиоты кишечника на Западе. Такие инициативы, как Global Microbiome Conservancy, активно пытаются отобрать, изучить и сохранить организмы, которые мы теряем по всему миру, в активном "банке посевного материала". Они собирают образцы из различных и недостаточно представленных популяций из более чем 30 стран мира, в том числе из популяций, ведущих исконный образ жизни, таких как охотники-собиратели. Благодаря их преданности делу и некоторой удаче мы сможем понять и сохранить микроорганизмы предков, которые приносят пользу здоровью человека.    "Это требует принятия мер", - говорит Блейзер. "Сначала нужно остановить разрушения, а потом восстанавливать".