Новости

Антибактериальные препараты уже несколько десятилетий используются в комбинациях с различными целями: для достижения синергизма (например, сульфаметоксазол-триметоприм), для ограничения резистентности (например, комбинации бета-лактамов и ингибиторов бета-лактамаз или противотуберкулезные схемы) и/или для расширения спектра действия антиинфекционного лечения (например, эмпирическое лечение сепсиса).    Поскольку резистентность к противомикробным препаратам (AMR) представляет собой глобальную угрозу здоровью населения и проникает во все сферы современной медицины, использование комбинаций лекарственных средств для ресенсибилизации резистентных штаммов стало перспективным способом преодоления застоя в области разработки лекарственных препаратов.    Несмотря на то, что в клиниках используется несколько антибактериальных комбинаций, а в последнее десятилетие все чаще проводятся скрининги соединений, одобренных в качестве адъювантов к антибиотикам, весь потенциал лекарственных комбинаций для лечения бактериальных патогенов остается недостаточно изученным. Это связано с тем, что комбинаторное пространство огромно, а лекарственные взаимодействия редки и зависят от концентрации, препарата, времени, вида и даже штамма, что делает необходимым систематическое тестирование, но требует больших усилий.    В результате, лекарственные взаимодействия многих клинически значимых видов бактерий еще не были систематически изучены. Кроме того, в связи с ростом распространенности полифармакологии антибиотики часто назначаются в комбинации с другими лекарственными средствами. В то время как фармакокинетические взаимодействия между антибиотиками и неантибиотическими препаратами хорошо известны для хозяина (например, зависимость от метаболизма и выведения препарата печенью и почками), они слабо охарактеризованы на уровне физиологии бактерий.    В данной работе мы использовали автоматизированную платформу для систематического профилирования лекарственных взаимодействий с тремя видами грамположительных бактерий: патогенными Staphylococcus aureus и Streptococcus pneumoniae, двумя наиболее распространенными антибиотикорезистентными бактериями, и модельным организмом Bacillus subtilis. По сравнению с предыдущими исследованиями это значительно увеличило количество препаратов, концентраций и тестируемых штаммов. Изучение всех основных классов антибиотиков позволило связать результаты взаимодействия со структурными особенностями бактерий, архитектурой клеточных сетей, а также с сохранением мишеней лекарственных препаратов.     При сравнении сетей лекарственных взаимодействий с сетями трех грамотрицательных патогенов, полученных с помощью аналогичной методики, были выявлены четкие различия, обусловленные различием барьеров проницаемости лекарственных веществ в этом сегменте. Кроме того, мы профилировали взаимодействие антибиотиков с большим набором неантибиотических препаратов у S. aureus, чтобы изучить влияние обычно применяемых лекарственных средств на эффективность антибиотиков. Таким образом, мы выявили как сильные синергетические эффекты, которые оказались эффективными в отношении клинических изолятов S. aureus с множественной лекарственной резистентностью, так и широко распространенные антагонизмы, которые могут снижать эффективность антибиотикотерапии.    В данном исследовании мы провели систематическое профилирование комбинаций лекарственных препаратов против трех видов грамположительных бактерий. Мы протестировали несколько соединений, относящихся к каждому из основных классов антибиотиков, используемых для лечения инфекций, вызванных грамположительными патогенами, а также забытые антибиотики, широко используемые адъюванты антибиотиков и перспективные неантибиотические препараты с зарегистрированной антибактериальной активностью. Комбинации тестировались в дозозависимом режиме, а взаимодействие оценивалось количественно.     В результате было выявлено множество лекарственных взаимодействий, о большинстве из которых ранее не сообщалось. Некоторые из выявленных синергизмов оказались эффективными в отношении множества протестированных нами MDR клинических изолятов, а также при инфекциях in vivo. Следует отметить, что это не означает, что такие синергизмы будут эффективны против всех изолятов MDR (как мы показали здесь и ранее, взаимодействия могут быть штаммоспецифичными), и комбинации должны быть протестированы на конкретном клиническом изоляте, против которого они направлены, перед их использованием, как это делается в клинике для отдельных препаратов.    Полученный нами массив данных может стать основой для будущих экспериментов по изучению ключевых взаимодействий или оценке возможности их клинического применения. Например, некоторые из выявленных синергизмов и антагонизмов могут стать основой для эмпирической терапии широкого спектра действия, когда в условиях дефицита времени (например, при сепсисе) схемы применения антибиотиков начинают без знания возбудителя. Синергизм фосфомицина, который является сильным и сохраняется в пределах разделения грамположительных и отрицательных микроорганизмов, является хорошим кандидатом, поскольку он с большей вероятностью будет широко эффективен. Фосфомицин все чаще используется в клиниках, но редко в комбинациях. Для дальнейшего использования этого ресурса мы сделали его доступным для просмотра в удобном интерфейсе.    Как и для грамотрицательных видов, для грамположительных видов мы обнаружили, что взаимодействие препаратов в значительной степени зависит от вида, причем синергизм, как правило, более консервативен, чем антагонизм, и обусловлен наличием у антибиотиков общих клеточных мишеней. Напротив, антагонизмы чаще встречаются между антибиотиками с разными клеточными мишенями и менее консервативны, предположительно потому, что они обусловлены взаимодействием на уровне концентрации препарата.    В целом лишь небольшое число взаимодействий является консервативным для грамположительных и грамотрицательных видов. Такие взаимодействия, скорее всего, обусловлены взаимодействием на уровне лекарственных мишеней и, следовательно, могут быть справедливы для штаммов и видов, не исследованных в данной работе, обеспечивая высокодостоверный набор данных для использования в будущем. Различия в организации клеточной поверхности (например, внешняя мембрана создает барьер проницаемости для гидрофобных соединений) или в степени избыточности ферментов, строящих клеточную стенку, могут объяснить некоторые из сильных синергических эффектов, наблюдаемых именно у грамположительных и грамотрицательных видов.    Возможность воспроизвести специфические для грамположительных бактерий синергизмы у гиперпроницаемых грамотрицательных бактерий, а также полученные ранее данные о сильной зависимости антагонизмов от проницаемости препаратов позволяют предположить, что синергизмы в большей степени зависят от мишеней препаратов, а антагонизмы - от внутриклеточных концентраций препаратов. Насколько это соответствует действительности и делает ли это антагонизмы менее консервативными (клеточные мишени лекарств более консервативны, чем их транспортные механизмы), еще предстоит выяснить. В любом случае, предположительно, именно по этой причине антагонизмы встречались чаще, чем синергизм у грамотрицательных видов, но не в данном исследовании: у грамположительных бактерий легче обнаружить синергизм, основанный на мишени препарата, а антагонизмы встречаются реже, поскольку здесь меньше узких мест проницаемости, которые необходимо преодолеть.    Мы также оценили комбинации одобренных неантибиотических препаратов с антибиотиками в дозозависимой манере в отношении S. aureus. Хотя потенциал взаимодействия был ниже для препаратов, не обладающих антибактериальной активностью, подавляющее большинство выявленных нами синергических эффектов были ранее неизвестны.     Хотя неантибиотические препараты предлагаются в качестве антиинфекционных адъювантов уже несколько десятилетий, их эффективность in vivo и молекулярные основы действия известны лишь для нескольких примеров. Мы остановились на антиагрегантном препарате тикагрелоре, который недавно было предложено использовать в качестве антиинфекционного адъюванта для борьбы с грамположительными бактериями. Хотя in vivo преимущества тикагрелора при системных инфекциях уже подтверждены, мы выявили 13 дополнительных синергических эффектов с антибиотиками в отношении S. aureus и представили молекулярные сведения о том, как тикагрелор влияет на физиологию S. aureus и потенцирует действие положительно заряженных антибиотиков, таких как аминогликозиды или низин.    Препараты регулярно комбинируются для лечения пациентов в клинике, причем не только в рационально разработанных терапевтических схемах, но и экстренно у пациентов, получающих полихимиотерапию. Хотя известных фармакокинетических взаимодействий, зафиксированных у человека, стараются избегать, предполагается, что взаимодействие между препаратами в бактериях не будет влиять на антиинфекционную эффективность. Мы обнаружили как синергизм, так и антагонизм между обычно назначаемыми неантибиотическими препаратами и антибиотиками в отношении S. aureus. Эти антагонизмы потенциально могут снижать эффективность антибиотикотерапии и повышать вероятность возникновения резистентности. В целом важно, чтобы лекарственные взаимодействия изучались не только на уровне ингибирования роста, но и на уровнях киллинга и клиренса инфекции, поскольку результаты взаимодействия могут быть различными.    Недавно было предложено использовать ослабление эффективности антибиотиков (антагонизм) для снижения побочного действия антибиотиков на комменсальные бактерии. В нашем исследовании наибольшее количество взаимодействий с антибиотиками наблюдалось у лоперамида. Хотя известны его потенциальное использование в качестве адъюванта для специфических антибиотиков и его антибактериальное действие, мы обнаружили дополнительный широкий антагонизм с макролидами. Лоперамид и макролиды часто назначаются совместно при диарее путешественников, вызываемой грамотрицательными энтерогенными патогенами. Заманчиво предположить, что отчасти положительный эффект этой комбинации обусловлен защитой грамположительных комменсалов кишечника от действия макролидов.    Таким образом, мы представили систематический и количественный отчет о взаимодействии препаратов против важных грамположительных видов. В результате был выявлен ряд мощных синергетических комбинаций, эффективных против клинических изолятов с MDR. Мы также изучили механизмы взаимодействия отдельных препаратов. В эпоху, когда разработка новых антибиотиков сталкивается с техническими и экономическими трудностями, а новые антимикробные стратегии являются насущной необходимостью, мы считаем, что систематическое профилирование лекарственных взаимодействий может предложить альтернативные решения для лечения бактериальных инфекций. Распространение систематического тестирования лекарственных взаимодействий (антибиотических и неантибиотических) на другие виды бактерий улучшит наше понимание принципов сохранения и механизмов лекарственных взаимодействий и позволит разработать индивидуальные методы лечения бактериальных инфекций.    Все полученные нами данные можно посмотреть в интерактивном интерфейсе (https://apps.embl.de/combact/).

Инфекции, вызванные грамотрицательными патогенами с множественной лекарственной резистентностью (MDR), в настоящее время представляют собой одну из самых серьезных глобальных проблем здравоохранения, а ВОЗ объявила их чрезвычайно важными в международном масштабе.     Главным среди этих патогенов является MDR Escherichia coli, которая ответственна за тревожный рост заболеваемости инфекциями кровотока и мочевыводящих путей, резистентными к антимикробным препаратам (AMR). MDR E. coli в значительной степени связана с носительством крупных MDR-плазмид, кодирующих бета-лактамазы расширенного спектра действия (ESBL) и карбапенемазы, такие как NDM, KPC и Oxa-48, которые придают резистентность соответственно к цефалоспоринам третьего поколения и карбапенемам. Интересно, что такие плазмиды крайне редко встречаются у кишечных патогенных E. coli, таких как E. coli O157 или распространенных энтеропатогенных и энтеротоксигенных штаммов E. coli. Напротив, носительство плазмид MDR сосредоточено в ряде линий, ответственных за внекишечный патогенез, таких как инфекции кровотока и мочевыводящих путей.    Внекишечные патогенные E. coli (ExPEC) - это название штаммов E. coli, способных вызывать внекишечные инфекции, но не представляющих собой филогенетически отдельную группу организмов. ExPEC встречаются в филогенезе видов, в основном в филогруппах B2, D и F. Недавние лонгитюдные исследования национальных изолятов инфекций кровотока показали, что наиболее распространенными линиями ExPEC являются ST131, ST73, ST69, ST95, ST410 и члены комплекса ST10, включая ST167. Не менее интересно и то, что плазмиды MDR не равномерно распределены между этими линиями ExPEC, а их носительство сосредоточено в небольшом количестве высокоуспешных клонов, распространившихся по всему миру. Наиболее успешным из таких клонов является клон С ST131, являющийся наиболее частой причиной MDR инфекций кровотока и мочевыводящих путей во всем мире. К другим распространенным линиям MDR E. coli относятся ST69, ST410, ST167 и ST648.    Вопрос о том, что делает определенные клоны или линии E. coli успешными патогенами с MDR, остается открытым. Недавний сравнительный анализ изолятов инфекции кровотока из Норвегии показал, что штаммы ST131 успешно доминировали в отсутствие носительства плазмид MDR, что указывает на то, что не только MDR является фактором их успеха. Проведенный в Великобритании лонгитюдный анализ изолятов показывает, что одной только MDR недостаточно для полного доминирования штаммов в эпидемиологическом ландшафте.    Последние данные свидетельствуют о том, что важным фенотипом, отличающим E. coli с MDR от других линий, является их способность быстро и бессимптомно колонизировать кишечный тракт человека. Исследование COMBAT, включавшее 1847 человек, путешествовавших из Нидерландов в Азию, Африку и Южную Америку, показало, что 34% из них приобрели в кишечном тракте ESBL E. coli во время путешествия, причем это число возросло до 75% среди путешествовавших в Азию. Из числа тех, кто был колонизирован в ходе исследования, 11% были колонизированы в течение 12 месяцев.    Небольшое исследование, проведенное среди студентов Бирмингемского университета, показало, что все участники, отправлявшиеся в Азию, были колонизированы ESBL E. coli, причем геномный анализ подтвердил, что это произошло из-за приобретения нового штамма с MDR, а не из-за того, что постоянная комменсальная E. coli стала MDR. В недавнем исследовании медицинского персонала, выезжавшего в Лаос, пробы отбирались в режиме реального времени и показали, что каждый человек был колонизирован MDR E. coli во время поездки, причем колонизация происходила в течение нескольких дней после прибытия.     Совсем недавно наша группа провела метагеномное секвенирование образцов, полученных в ходе исследования COMBAT, и показала, что при колонизации людей MDR E. coli не было обнаружено заметного влияния на разнообразие или состав микробиома кишечника в целом. Несмотря на то, что обсервационные исследования позволили получить данные, позволяющие выдвинуть гипотезу о конкуренции между штаммами, этот факт никогда не проверялся непосредственно in vivo.    Исследования генетических детерминант, дифференцирующих линии MDR E. coli от остальной популяции, также выявили ряд параллельных наблюдений. Исследования, сравнивающие ST131 из клада С с его предковой популяцией, показывают набор адаптивных нуклеотидных замен в хромосомных промоторных областях, связанных со специфической плазмидой, носителями которой является данный штамм, что также наблюдалось у ST167. Изучение ST131 с использованием пангеномного подхода для выявления аллельных вариаций в генах показало, что число нуклеотидных замен в генах, участвующих в колонизации млекопитающих, включая анаэробный метаболизм, приобретение железа и адгезинов, сильно увеличено. Подобная картина не наблюдалась у успешных линий ExPEC без MDR, таких как ST73. Подобное аллельное разнообразие генов анаэробного метаболизма наблюдалось также у ST167 и ST648, а также было показано, что рекомбинация новых аллелей генов поглощения железа fhu стала ключевым эволюционным событием, обусловившим появление карбапенем-резистентного клона B4/H24RxC в линии ST410. Мы предполагаем, что эти генетические адаптации могут способствовать более эффективной колонизации кишечника млекопитающих.    В данной работе мы использовали гнотобиотическую мышиную модель колонизации кишечника для непосредственной проверки гипотезы о том, что MDR E. coli может превзойти комменсальные E. coli посредством межштаммовой конкуренции и установить доминирующую колонизацию кишечного тракта in vivo в отсутствие какой-либо антибиотической селекции. Мы продемонстрировали, что штамм ST131 с MDR может конкурировать с комменсальными штаммами, обеспечивая колонизацию кишечника у гнотобиотических мышей. Более того, при введении в кишечник мышей, предварительно колонизированных комменсальными кишечными палочками, MDR ST131 может вытеснить комменсальные E. coli из кишечника и установить доминирующую колонизацию.     Вытеснение резидентного комменсального штамма происходит в течение 48 ч после совместного проживания с мышами, колонизированными MDR ST131, причем ST131 становится доминирующим штаммом у всех совместно проживавших мышей. Для понимания биологических процессов, лежащих в основе этой конкуренции, мы использовали фенотипический микрочип Biolog, который позволяет выявить изменения в утилизации источников углерода. Целенаправленное геномное сравнение анализируемых штаммов позволяет выявить различные мутационные сигнатуры. Далее мы распространили этот анализ на массив данных из 19 571 генома, представляющих все филогенетическое и AMR-разнообразие E. coli, чтобы выявить существенную связь между метаболизмом и носительством AMR-генов. Мы обнаружили, что линии MDR E. coli демонстрируют повышенное нуклеотидное разнообразие в генах, связанных с утилизацией углеводов, что может обеспечить конкурентные преимущества при колонизации кишечника млекопитающих по сравнению с комменсальными штаммами E. coli.    В совокупности наши данные свидетельствуют о том, что MDR E. coli обладает высокой способностью к колонизации кишечника хозяина, вытесняя резидентную комменсальную E. coli, становясь доминирующим штаммом и легко передаваясь между хозяевами. Проведенный нами геномный анализ указывает на то, что метаболизм является ключевым фактором в эволюции AMR, связанным с невероятной способностью MDR E. coli к колонизации кишечника.