Новости

В недавнем обзоре, опубликованном в журнале Nature Medicine, исследователи представили проблемы, связанные с клиническим применением технологии рибонуклеиновой кислоты-мессенджера (мРНК), последние инновации и будущие направления для повышения клинической эффективности наномедицины на основе мРНК.    Терапевтическая эффективность модифицированных нуклеозидами мРНК вакцин Pfizer-BioNTech и Moderna против COVID-19 стимулировала развитие мРНК-наномедицины для расширения терапевтического ландшафта ряда заболеваний, таких как COVID-19 и рак. Научный прогресс в разработке и доставке мРНК в значительной степени решил проблемы, связанные с использованием мРНК в клинических условиях. В настоящем обзоре исследователи представили основные достижения в области наномедицины мРНК и связанные с ними проблемы, которые необходимо решить для раскрытия истинного терапевтического потенциала технологии мРНК.    Мессенджерная РНК переносит генетическую информацию от ДНК к рибосомам, где эта информация далее транслируется в белки. Доставка мРНК, экспрессирующей антигены раковых или инфекционных заболеваний, компоненты генного редактирования или терапевтические белки, ассоциированные с заболеваниями, позволяет реализовать такие клинические приложения, как вакцины, генное редактирование и белковая терапия. Впервые мРНК была открыта в 1961 году и доставлена in vivo с помощью полимерных частиц в 1976 году; через два года была осуществлена доставка мРНК в клетки мышей и человека с помощью липосом.    В 1995 году вакцина против рака на основе мРНК была впервые испытана на мышах. По прошествии десяти лет исследования сообщили, что модификации нуклеозидов снижают сигнализацию толл-подобных рецепторов (TLR) в ответ на активность мРНК. В период с 2008 по 2012 год исследования показали, что модификации нуклеозидов могут подавлять активацию 2′-5′-олигоаденилат синтетазы и протеинкиназы R38 (PKR38), предотвращать расщепление, вызванное рибонуклеазой (RNase) L51, и повышать стабильность и трансляцию мРНК.    В 2017 году были проведены клинические испытания противораковых вакцин на основе мРНК. Три года спустя вакцины против SARS-CoV-2 BNT162b2 и мРНК-1273 были одобрены правительством США для экстренного применения. В 2021 году в исследованиях сообщалось, что липидные наночастицы (LNPs) могут быть использованы в качестве адъювантов в мРНК-вакцинах против SARS-CoV-2.    Основными препятствиями для клинического применения мРНК являются нестабильность, эффективность трансляции и иммуностимулирующий потенциал экзогенной мРНК. Существующие методы синтеза мРНК не позволяют удалить такие примеси, как двухцепочечная РНК и фрагменты РНК, которые снижают терапевтическую эффективность и вызывают нежелательные биологические реакции при клиническом использовании. Кроме того, мРНК представляет собой большой, отрицательно заряженный, одноцепочечный полинуклеотид, который с трудом проходит через отрицательно заряженные клеточные мембраны.    После местной или системной доставки мРНК сталкиваются с такими проблемами, как быстрая деградация нуклеазами, удаление при фагоцитозе макрофагами и клиренс при почечной фильтрации. Большинство интернализованных мРНК задерживаются в эндосомах и могут быть обнаружены эндосомальными РНК-сенсорами (TLR3, TLR7 и TLR8) и цитозольными РНК-сенсорами (такими как ген-I, индуцируемый ретиноевой кислотой (RIG-I) и ассоциированный с дифференцировкой меланомы белок 5 (MDA5), которые снижают трансляцию и стабильность мРНК. Связывание цитозольной мРНК и эффективность трансляции могут быть улучшены с помощью оптимизированного дизайна 5′ кэпа.    Оптимизация нетранслируемой области (UTR) и использование поли(А) фрагмента длиной 100-150 нуклеотидов могут улучшить трансляцию и стабильность мРНК. Идентификация новых последовательностей UTR с помощью глубинного машинного обучения или высокопроизводительного скрининга может улучшить экспрессию мРНК, а рациональные комбинации 5′ и 3′ могут максимизировать эффективность трансляции мРНК. Модификация нуклеозидов, очистка мРНК, химико-ферментная модификация и дизайн кэпа 5′ могут модулировать иммуностимуляцию мРНК.    Терапевтическая мессенджерная рибонуклеиновая кислота обычно синтезируется in vitro с использованием линейной ДНК в качестве шаблона и фермента РНК-полимеразы и впоследствии очищается. Молекула мРНК состоит из 5′ UTR, кодирующей белок открытой рамки считывания (ORF), 5′ кэпа, поли(А) фрагмента и 3′ UTR. Для синтеза мРНК используются последовательности UTR из β-глобина человека. Использование модифицированных нуклеозидов, таких как псевдоуридин (ψ), 5-метилцитидин, N6 -метиладенозин, 5-метилуридин и 2-тиоуридин, может снизить выработку цитокинов за счет предотвращения распознавания TLRs и снижения активности PKR38 и 2′-5′-олигоаденилат синтетазы. Замена части нуклеозидов на 2-тиоуридин и 5-метилцитидин снижает активацию RIG-1. Для клинической трансляции мРНК экспрессируется в клетках-мишенях и очищается с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии для удаления контаминантов двухцепочечной РНК и повышения экспрессии белка в клетках без иммуностимуляции.    В настоящее время мРНК производятся со структурой cap-1 путем ко-транскрипционного кэпирования, при этом эффективность трансляции остается удовлетворительной. Транспортные средства для доставки мРНК защищают мРНК от деградации, преодолевают различные биологические барьеры и эффективно доставляют мРНК в цитоплазму для экспрессии белка. В настоящее время используются такие носители, как LNPs, липидно-полимерные гибридные наночастицы и полимерные наночастицы.    Последние инновации в области доставки мРНК включают платформу PEG10-вирусоподобной частицы (VLP) и платформу протео-липидного транспортного средства fusogenix. Инновации в области инженерии мРНК включают циркулирующую РНК и самоамплифицирующуюся РНК. Самоциркуляция РНК повышает стабильность мРНК и обеспечивает длительную трансляцию белка. Платформа PEG10- VLP включает белок PEG10 для упаковки мРНК и фузоген синцитин А (SYNA) для нацеливания на клетки для прямой внутрицитоплазматической доставки мРНК.    В целом, результаты обзора подчеркнули огромный потенциал технологии мРНК в области наномедицины. Успех мРНК-вакцины COVID-19 воодушевил, и ожидается, что все больше методов лечения на основе мРНК будут использоваться в клинической практике. Однако необходимо провести дальнейшие исследования для улучшения понимания биологических путей, влияющих на доставку и трансляцию мРНК in vivo, с учетом иммуностимуляции и потенциальной токсичности агентов на основе мРНК.

Есть ли способ очистить организм от бактериальных токсинов или вирусных частиц до того, как они разрушат ткани организма? С помощью клеточных наногубок - да.   Иногда называемые биомиметическими наночастицами или наночастицами, имитирующими клетки, наногубки состоят из полимерных наночастиц, обернутых в мембраны, полученные из различных типов клеток, от эритроцитов до макрофагов. Поскольку они сохраняют рецепторы и мембранные структуры естественных клеток, наногубки можно использовать в качестве ловушек, чтобы предотвратить вмешательство патогенов и их вредных продуктов в жизнь человека. Хотя наногубки еще не готовы к клиническому применению, растущий список приложений этой технологии - от гашения чрезмерно активных иммунных реакций до доставки лекарственных препаратов к определенным тканям и клеткам - создает основу для переноса этих частиц с лабораторного стола на больничную койку.Что такое наногубки и как их делают?   Клеточные наногубки - это наночастицы, заключенные в клеточные мембраны природного происхождения. Они являются частью развивающейся области наномедицины - использования материалов и устройств на молекулярном уровне для улучшения здоровья и борьбы с болезнями. Наночастицы создаются из различных материалов (например, липидов, серебра, золота, природных или синтетических полимеров) и находят разнообразное биомедицинское применение, включая доставку лекарств, маркировку клеток и визуализацию.   Как создается наногубка? По сути, ученые начинают с клеток человека-хозяина и "используют комбинацию физических методик для удаления внутриклеточного содержимого", - рассказывает Лянфан Чжан, научный основатель Cellics Therapeutics (компании, использующей технологию клеточных наночастиц для лечения и профилактики заболеваний). "Затем мы собираем плазматическую мембрану клетки и наносим ее на биоразлагаемую, биосовместимую поверхность наночастиц".   Например, для получения наногубок из эритроцитов исследователи сначала лизируют клетки, помещая их в гипотонический раствор. Эти "призраки эритроцитов" (т.е. пустые мембраны) затем разрушаются с помощью ультразвука, в результате чего образуются мембранные везикулы. Наночастицы, созданные из поли(молочно-когликолевой кислоты) - PLGA, биоразлагаемого полимера, одобренного для клинического использования Управлением по контролю за продуктами и лекарствами США (FDA), - смешиваются с раствором везикул. Цель частиц PLGA - обеспечить структурную поддержку для клеточных мембран. Соответственно, смесь везикул и полимера механически выдавливается через пористую мембрану, сила которой проталкивает частицы PLGA через мембраны эритроцитов.   Чжан, который изобрел технологию наногубок и сыграл важную роль в ее развитии, подчеркнул, что одна естественная клетка может быть разбита на тысячи везикул. Это привлекательно с точки зрения производства, так как позволяет ученым генерировать огромное количество наногубок из относительно небольшого количества естественных клеток.   В связи с этим, должны ли наногубки генерироваться из собственных клеток человека, чтобы они были переносимы и эффективны? По мнению Чжана, нет. Он отметил, что для своих наногубок из эритроцитов Cellics использует эритроциты группы О, которые совместимы с большинством людей. Компания также разрабатывает основную клеточную линию для производства макрофагальных наногубок, в которых отсутствуют поверхностные молекулы, способные вызвать иммунный ответ, что обеспечивает их переносимость и широкое применение среди пациентов.   Дополнительное преимущество: клеточные наногубки могут быть суспендированы в растворе или лиофилизированы, что делает их стабильными для длительного хранения. Более того, каждая наногубка "состоит всего из двух компонентов - клеточной мембраны и биоразлагаемого полимера", - пояснил Чжан. "Когда она попадает в организм [через инъекцию], полимер распадается на мономеры и в конечном итоге метаболизируется в воду и углекислый газ, не оставляя в организме ничего токсичного".Как используются наногубки?   Потенциальные возможности использования наногубок ограничены только разнообразием рецепторов на поверхности клетки, но даже это может быть изменено с помощью небольшой генной инженерии. Учитывая это, ученые начинают понимать, насколько универсальными могут быть наногубки.   Когда вирусы вторгаются в организм, они прикрепляются к клеткам-хозяевам и захватывают внутренние механизмы для репликации. Цель противовирусных соединений - предотвратить инфекцию, в частности, путем связывания с клеткой-хозяином (или вирусом) для блокирования проникновения вируса и его репликации. Однако разработка противовирусных препаратов, которые подавляют вирусную репликацию, но при этом не затрагивают нормальные клеточные процессы, может оказаться сложной задачей.   Именно здесь наногубки демонстрируют большой потенциал: вместо того чтобы вмешиваться в работу естественных клеток, они притворяются ими. То есть, поскольку наногубки выглядят как клетки хозяина, вирусы ошибочно связываются с рецепторами на их поверхности. После связывания вирусные частицы застревают и, таким образом, не могут инфицировать настоящие клетки. Например, Чжан и его коллеги обнаружили, что после инкубации с наногубками, созданными из клеток альвеолярного эпителия человека и макрофагов, SARS-CoV-2 не смог заразить настоящие клетки.   В другом исследовании ученые создали клеточные наночастицы, используя человеческие моноциты. Они обнаружили, что полученные из моноцитов "нанодекоиды" подавляют репликацию и инфекцию SARS-CoV-2. Такое ингибирование может быть усилено путем увеличения количества гепарина (клеточного рецептора, который SARS-CoV-2 использует для проникновения в клетки, помимо ACE2) на поверхности наногубки. И это не только в случае с SARS-CoV-2. Группа Чжана показала, что наногубки, имитирующие Т-клетки, могут нейтрализовать ВИЧ-1, тем самым защищая естественные Т-клетки от инфекции и демонстрируя потенциал наногубок для борьбы с различными вирусами.Нейтрализация бактериальных токсинов   Наногубки также полезны в контексте бактериальных инфекций. Действительно, многие бактерии выделяют порообразующие токсины, которые лизируют и убивают клетки хозяина; по словам Чжана, существует более 80 семейств порообразующих токсинов. Однако все они имеют одну общую черту: их рецепторы находятся на клеточной мембране. Наногубки, с их разнообразным репертуаром поверхностных рецепторов, широко связываются с токсинами и очищают их до того, как они нанесут клеточный ущерб. Это может "повлиять на колонизацию бактерий, их распространение, а также помочь иммунной системе избавиться от патогена", - пояснил Чжан. Суспензия эритроцитов (слева). Без гемолиза (в середине) эритроциты оседают на дне пробирки. Инкубация с гемолизином бактерии Streptococcus pyogenes вызывает лизис клеток, образуя прозрачную суспензию (справа). Фото: Y tambe/Wikimedia Commons.    Например, полученные из эритроцитов наногубки связывают стрептолизин О, порообразующий токсин, выделяемый стрептококком группы А, и блокируют его способность убивать макрофаги и нейтрофилы. Эти иммунные клетки могут свободно бороться с микробной угрозой. Наногубки, полученные из эритроцитов, также могут подавлять гемолиз (т.е. разрыв эритроцитов), вызываемый альфа-гемолизином, выделяемым метициллин-резистентным Staphylococcus aureus, и листериолизином O из Listeria monocytogenes, а также другими токсинами.   Примечательно, что в отличие от антибиотиков, наногубки не оказывают селективного давления на патогены. Они эффективны независимо от профиля лекарственной резистентности микроорганизма. Таким образом, сочетание антимикробных препаратов с наногубками может стать жизнеспособным вариантом для "обезвреживания" патогена и его уничтожения с помощью иммунных и лекарственных механизмов.   Более того, отметил Чжан, вылавливая антигены бактериальных токсинов с помощью наногубок, антигены становятся безопасными. Поскольку они уже связаны с клеточной мембраной, они выполнили свою задачу. Наногубки, связывающие токсины, временно циркулируют в кровотоке, а затем в конце концов разрушаются. Таким образом, покрытые токсинами наногубки могут быть использованы в качестве мультивалентных вакцин. Например, вакцинация с помощью полученных из макрофагов наногубок, покрытых факторами вирулентности Pseudomonas aeruginosa, привела к "быстрому и длительному иммунитету" против пневмонии у иммунодефицитных мышей.Умеренный иммунный ответ   Инфекция - это сложный танец между патогеном и иммунной системой хозяина. Иммунные клетки обнаруживают вторгшиеся микробы и непосредственно борются с ними, одновременно выделяя цитокины и другие факторы, регулирующие ответную реакцию. Иногда эти факторы приносят больше вреда, чем пользы. В качестве примера Чжан привел сепсис: инфекция патогена стимулирует макрофаги выделять цитокины, которые активируют еще больше макрофагов и других иммунных клеток, что в конечном итоге приводит к "цитокиновому шторму", отказу органов и, возможно, смерти.   Чжан описал, как полученные из макрофагов наногубки "полезны при сепсисе. Благодаря наличию всех этих естественных клеточных рецепторов на макрофаге, они могут быть использованы для адсорбции и нейтрализации всех соответствующих факторов в организме". То есть, действуя как приманка для макрофагов, наногубки могут связывать и нейтрализовать бактериальные эндотоксины, которые запускают воспалительный каскад, связанный с сепсисом, одновременно поглощая цитокины, которые усиливают повреждающий ответ. Идея, по словам Чжана, заключается не в том, чтобы парализовать иммунный ответ, а в том, чтобы ослабить его настолько, чтобы предотвратить вред организму. По этой причине наногубки также исследуются для лечения аутоиммунных заболеваний, которые характеризуются чрезмерно активными, самонаправленными иммунными реакциями.Доставка лекарственных препаратов по всему организму   Наногубки естественным образом пусты, но это не обязательно так. Они могут быть загружены лекарственными препаратами для доставки по всему организму. Недавнее исследование показало, что полученные из макрофагов наногубки, нагруженные лопинавиром, модельным противовирусным препаратом с активностью in vitro против SARS-CoV-2, могут облегчить воспаление и снизить вирусную нагрузку на ткани в мышиной модели коронавирусной инфекции. Поскольку наногубки сохраняют сигнальные структуры естественных клеток, они также могут доставлять лекарства в определенные участки тела.    Действительно, Чжан с коллегами создали наногубки из клеток, генетически модифицированных для экспрессии белка VLA-4, который тесно связывается с VCAM-1, молекулой, обычно повышающей уровень воспаленных эндотелиальных клеток. Наногубки показали улучшенную доставку противовоспалительного препарата дексаметазона в воспаленную ткань в мышиной модели воспаления легких. Результаты показывают, что, используя естественное взаимодействие лиганда и мишени, наногубки могут быть запрограммированы на доставку терапевтической нагрузки в определенные клетки и ткани.Клиническое будущее наногубок   При всей своей перспективности, Чжан заявил, что клеточные наногубки "еще не вышли на рынок". Большинство исследований проводилось in vitro и на животных моделях. Кроме того, существуют проблемы, связанные с масштабированием производства наногубок до уровня, необходимого для клинических испытаний и использования человеком. Например, "уникальные биологические и межфазные свойства" клеточных мембран означают, что создание однородности от партии к партии может быть затруднено. То, что наногубки являются нетрадиционным методом лечения, еще больше усложняет ситуацию, "потому что когда что-то является нетрадиционным, это означает, что нет существующего подхода или установленной методологии", - отмечает Чжан. Он описал трудности, связанные с разработкой анализов для контроля качества in vitro и определением места терапии в нормативной базе FDA.   Тем не менее, несмотря на эти трудности, наногубки начали путь к клиническому применению. Недавно FDA одобрило заявку компании Cellics на исследование ее нового лекарственного препарата-кандидата CTI-005, наногубок из эритроцитов человека. Компания планирует начать клинические испытания фазы 1b/2a, в ходе которых будет изучаться безопасность и потенциальная эффективность продукта у людей, госпитализированных с пневмонией, вызванной метициллин-резистентным Staphylococcus aureus (MRSA) или метициллин-чувствительным Staphylococcus aureus (MSSA), а также другие продукты (например, макрофагальные наногубки для лечения воспалительных заболеваний кишечника и сепсиса).