Цифровой анализ для быстрого электронного количественного определения клинических патогенов с использованием ДНК-наношариков (аннотация)
#новые технологии
Быстрое и точное обнаружение генетического материала является краеугольным камнем диагностики с широкими возможностями применения, включая выявление инфекционных заболеваний и их биомаркеров.
Недавняя пандемия привела к возрождению методов диагностики, нацеленных на вирусные нуклеиновые кислоты или белки. Благодаря присущей им простоте и масштабируемости, широкое распространение получили белковые методы диагностики, такие как иммунохроматографическая экспресс-детекция антигенов. Однако тесты на основе белков требуют разработки высококачественных антител и поэтому были внедрены сравнительно поздно в период пандемии.
Количественная полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (RT-qPCR) является золотым стандартом для выявления нуклеиновых кислот и широко применяется для диагностики. В дополнение к RT-qPCR было разработано несколько других методов, основанных на использовании нуклеиновых кислот. Особое значение имеют подходы, основанные на изотермической амплификации, которые отличаются простотой реализации и масштабируемостью даже в условиях ограниченных ресурсов. Среди них одним из наиболее популярных является петлевая изотермическая амплификация (LAMP).
В реакции LAMP используются от четырех до шести олигонуклеотидов, нацеленных на интересующий регион, и полимераза, расщепляющая нити ДНК. Поскольку для ее проведения не требуется термоциклер, она является простой, недорогой, но чувствительной альтернативой стандартной ПЦР. LAMP в сочетании с обратной транскриптазой (RT-LAMP) широко используется для выявления патогенов. Выявление ДНК после LAMP может быть достигнуто с помощью различных методик, включая гель-электрофорез, флуоресцентные и колориметрические методы.
Флуоресцентные методы, хотя и успешно применяются, увеличивают стоимость реагентов и требуют сложных систем считывания или интеграции со специализированными платформами. В качестве альтернативы колориметрические методы обеспечивают простое визуальное изменение цвета в ответ на выработку ионов H+. Однако такой подход чреват ложными срабатываниями, например, исходная слюна может быть кислой, что требует дополнительных действий перед тестированием для нейтрализации таких образцов.
Методы обнаружения ДНК обычно основаны на флуоресцентном или колориметрическом считывании. Разработка методов, не содержащих меток, позволяет снизить стоимость и сложность тестов. Электрохимическая детекция амплификации ДНК путем измерения изменения импеданса является отличной альтернативой флуоресцентным и колориметрическим методам. В этом случае на интересующий материал подается возбуждающее напряжение с определенной частотой, и регистрируется отклик, зависящий от импеданса материала.
Биосенсоры на основе импеданса с высокой чувствительностью используются для определения широкого спектра аналитов, включая белки, нуклеиновые кислоты и раковые клетки. Кроме того, в последние десятилетия благодаря технологическому прогрессу произошла быстрая миниатюризация электронных компонентов, что позволило повысить их портативность и относительно удешевить производство. Кроме того, существенное снижение требований к объему исходного материала еще больше расширяет возможности проведения теста на месте оказания помощи (point-of-care, POC).
Ранее мы успешно проводили количественное определение ДНК различной концентрации и длины с помощью импедансной детекции в микрофлюидном чипе. Однако этот подход требовал использования микробусинок. Это увеличивает стоимость и сложность, что исключает возможность его использования в условиях ограниченных ресурсов. Продемонстрировано также импедансное детектирование молекул ДНК в растворе, однако такое детектирование не позволяет различать различные целевые последовательности ДНК или РНК. Таким образом, существует потребность в новых подходах к диагностике с помощью импеданса без меток, использующих многочисленные преимущества электрической детекции (например, быстрота, точность, малые размеры, дешевизна, масштабируемость и т.д.) для специфических целевых последовательностей, что приближает нас к созданию системы POC.
В данной работе мы создали упрощенный метод изотермической амплификации нуклеиновых кислот, позволяющий детектировать их по изменению электрического импеданса без использования микробусинок в качестве внешних нуклеирующих агентов. Мы модифицировали реакцию RT-LAMP для самонуклеации амплифицированной ДНК в наношарики, которые могут быть обнаружены с помощью недорогой и простой электрической системы детекции. Мы показали, что пассивное течение образовавшихся самособирающихся наношариков ДНК мимо двух детектирующих электродов в простом микрофлюидном канале генерирует скачки импедансного сигнала.
Для демонстрации применимости этой технологии мы использовали ее для обнаружения SARS-CoV-2. Количество обнаруженных пиков соответствовало количеству амплифицированной ДНК и, следовательно, более высоким концентрациям вируса. В дальнейшем мы продемонстрировали обнаружение множества патогенных последовательностей ДНК и РНК, включая ВИЧ, грипп, микобактерии туберкулеза и β-лактамазы из различных вирусных и бактериальных источников, что открывает путь к созданию новой и простой импедансной мультипатогенной системы обнаружения нуклеиновых кислот. Мы ожидаем, что его интеграция в автономное устройство обеспечит недорогой (<5 долларов), чувствительный (10 копий мишени) и быстрый тест (<1 часа).
