Около 39 триллионов микробов процветают на нас и внутри нас в непрерывной, взаимозависимой суете.
Вместе они составляют более половины клеток человеческого тела, хотя обладают в 500 раз большим количеством генов, чем человеческие клетки. Выявление и осмысление этого микробного многообразия было одной из главных задач исследователей. В новом исследовании ученые описывают новый метод беспрецедентно детального изучения микробиома. Этот метод более прост и удобен в использовании по сравнению с существующими подходами. Исследователи демонстрируют улучшенную способность точно определять биологически значимые характеристики, включая возраст и пол субъекта, на основе образцов микробиома. Для раскрытия многообразия и сложности микробиома исследователям были использованы 16S и метагеномное секвенирование. Технология, описанная в исследовании, опубликованном в текущем выпуске журнала mSystems, использует сильные стороны обоих методов для создания нового способа обработки данных микробиома.
"Мы взяли некоторые рекомендации, которые были разработаны на основе секвенирования 16S РНК, и применили их в метагеномике", - говорит руководитель исследования профессор Цюйюнь Чжу из Университета Аризоны. В отличие от других методов секвенирования, включая 16S, метагеномика позволяет исследователям секвенировать всю информацию о ДНК, присутствующую в образце микробиома. Однако новое исследование показывает, что в метагеномном подходе есть возможности для совершенствования. "То, как специалисты в настоящее время анализируют метагеномные данные, ограничено, поскольку данные о целых геномах сначала должны быть переведены в таксономию".
Новый метод, получивший название метода операционных геномных единиц (Operational Genomic Units - OGU), позволяет отказаться от трудоемкой и иногда вводящей в заблуждение практики присвоения таксономических категорий, таких как род и вид, множеству микробов, присутствующих в образце. Вместо этого метод использует отдельные геномы в качестве основных единиц для статистического анализа и просто пытается сопоставить присутствующие в образце сиквенсы с сиквенсами, найденными в существующих геномных базах данных.
Благодаря этому исследователи могут получить гораздо более высокое разрешение, что особенно полезно, когда в образце присутствуют микробы, близкородственные по ДНК. Это верно, поскольку большинство таксономических классификаций основано на сходстве сиквенсов. Если два сиквенса различаются менее чем на определенное пороговое значение, они попадают в одну и ту же таксономическую категорию, однако подход OGU может помочь исследователям отличить их друг от друга. Кроме того, метод преодолевает ошибки в таксономии, сохранившиеся как пережиток эпохи до секвенирования, когда различные виды определялись по их морфологии, а не по данным секвенирования ДНК. Помимо улучшения разрешающей точности и простоты, OGU может помочь исследователям анализировать данные, используя так называемые филогенетические деревья. Как следует из названия, это ветвящиеся структуры, которые могут описывать степень родства между организмами на основе сходства их сиквенсов. OGU не зависит от таксономической классификации, обеспечивая возможность получения максимального разрешения состава сообщества, и организует признаки в точную иерархию с помощью филогенетического дерева.
Наиболее широко используемый метод исследования микробиома, известный как секвенирование 16S рибосомальной РНК или просто 16S, основан на простой идее. Все бактерии имеют ген 16S, который необходим для работы механизмов, необходимых бактериям для начала синтеза белка. Бактериальный 16S ген, длина которого составляет 1500 пар оснований, состоит из отдельных областей. Некоторые из этих регионов мало изменяются у разных бактерий и в течение эволюционного периода, в то время как другие сильно изменчивы. Исследователи обнаружили, что консервативные и вариабельные области гена 16S позволяют ему действовать как молекулярные часы, отслеживая бактерии, которые находятся в более близком или более отдаленном родстве, на основе сходства их последовательностей. В результате выяснилось, что 8 консервативных и 9 вариабельных областей гена 16S могут быть использованы для "дактилоскопии" бактерий.
Для этого сначала берется образец микробиома. Это может быть образец кала, чтобы оценить микробиом кишечника, или образец с кожи или из полости рта. На каждом участке тела обитает свой бактериальный зверинец. Далее используется технология ПЦР для амплификации части гена 16S. Секвенирование высококонсервативных областей позволяет идентифицировать широкий спектр бактерий, а секвенирование вариабельных областей помогает установить идентичность конкретных бактерий. Хотя 16S - недорогой и хорошо отработанный метод, у него есть ограничения. Этот метод может дать лишь общее представление о видах присутствующих бактерий с ограниченным разрешением. В целом, 16S точен только на уровне рода.
На помощь приходит метагеномное секвенирование. Этот метод позволяет секвенировать полные геномы всех микроорганизмов, присутствующих в образце микробиома. Метагеномика позволяет исследователям параллельно секвенировать тысячи организмов, обеспечивая точное разрешение на уровне вида. Однако за более высокое разрешение приходится платить. Метагеномные данные гораздо более насыщены и сложны для анализа с точки зрения вычислений, чем данные 16S, а их обработка требует больших затрат времени и денег.
Метод OGU упрощает метагеномное секвенирование, обеспечивая при этом еще большее разрешение. Подход классифицирует микроорганизмы в образце строго в соответствии с их соответствием эталонной базе данных - таксономическая классификация не требуется. Этот подход позволяет исследователям оценить степень видового разнообразия, присутствующего в образце. По сравнению с 16S-секвенированием и стандартным метагеномным секвенированием, новый подход лучше в поиске биологически значимой информации. Используя классическую базу данных Human Microbiome Project из 210 метагеномов, отобранных из семи участков тела мужчин и женщин, исследование продемонстрировало более четкую корреляцию между участком тела и полом хозяина.
Далее были проанализированы 6430 образцов кала, собранных путем случайной выборки финского населения, с использованием 16S и метагеномного секвенирования. Образцы принадлежат к большой когорте финского населения, отобранной методом случайной выборки, известной как FINRISK. Целью исследования было предсказать возраст отобранных людей на основе микробного состава кишечника. И снова метод OGU превзошел 16S и обычный метагеномный анализ, обеспечив более точные результаты.
Предстоящие исследования с использованием еще больших массивов данных позволят еще больше повысить разрешающую способность нового метода и расширить описательные возможности независимого от таксономии анализа.
