Новости

Традиционное секвенирование часто сравнивают с приготовлением коктейля: исследователи смешивают кучу клеток, получают усредненную последовательность и делают выводы об ингредиентах, из которых состоит эта смесь.     Совсем недавно ученые получили возможность проводить секвенирование отдельных клеток, что позволяет выявить редкие различия между клетками и эволюцию клеточных линий. Однако существующие методы требуют чтения генома короткими участками и поэтому часто не могут охватить сложные повторяющиеся области, которые ученые все чаще связывают со здоровьем и заболеваниями. Технологии длинного прочтения могут преодолеть этот недостаток, однако их методы требуют гораздо больше ДНК, чем можно извлечь из одной клетки. Секвенирование с длинным прочтением для одной клетки оставалось труднодоступным.    Так было до сих пор. Объединив "два инновационных подхода" - передовую технику амплификации ДНК и последние достижения в секвенировании ДНК - группа ученых применила технологию длинного прочтения к одиночным клеткам, рассказывает Александр Хойшен, исследователь геномных технологий в Медицинском центре Университета Радбоуда в Нидерландах, который не принимал участия в исследовании. "Это было немыслимо всего два-три года назад", - говорит он. Это достижение может позволить более детально изучить мутации, лежащие в основе всевозможных заболеваний.    В последнее десятилетие длина считывания - результат секвенирования ДНК - становится все более значительной. Секвенирование с длинными считываниями позволило ученым определять последовательность проблемных "темных областей" генома, недоступных для технологий с короткими считываниями, либо из-за обилия гуанинов и цитозинов, либо из-за дублированных областей, которые трудно картировать на хромосоме.    Однако для секвенирования с длинным прочтением требуется огромное количество ДНК. Необходимо несколько микрограммов генетического материала, но "одна клетка содержит всего шесть пикограмм", - поясняет Джоанна Хорд, специалист по вычислительной биологии. По ее словам, "прежде чем вы сможете составить последовательность, требуется значительная амплификация".    И именно здесь возникают сложности, говорит Хорд, поскольку основные методы, используемые для амплификации ДНК, подвержены "смещению амплификации": тенденции к увеличению числа определенных последовательностей за счет других. И вот недавно, Хорд и коллеги получили длинные прочтения из отдельных клеток с помощью усовершенствованного метода амплификации ДНК. Хотя эти результаты еще не прошли рецензирование, они были опубликованы в препринте, загруженном на bioRxiv 23 января.    Чтобы минимизировать смещение амплификации, команда использовала метод, называемый капельной амплификацией с множественным смещением (droplet-based multiple displacement amplification). Он работает путем захвата фрагментов ДНК в капли, содержащие ограниченный запас реагентов, что предотвращает чрезмерную амплификацию определенных регионов. "Происходит более равномерная амплификация, что позволяет лучше представить геном", - пояснил Адам Амер, биоинформатик из Уппсальского университета в Швеции.    Исследователи проводили амплификацию на основе капель в отдельных человеческих Т-лимфоцитах, а затем генерировали длинные чтения с помощью технологии PacBio HiFi. По сравнению с секвенированием с короткими чтениями, новый метод позволил выявить в четыре раза больше структурных вариантов - крупных перестроек ДНК, включая те, которые расположены в недоступных "темных областях" генома.    Исследователи использовали новый подход для секвенирования ДНК двух разных Т-клеток, полученных от одного и того же человека. Данные секвенирования выявили 28 соматических мутаций, отличающих эти две клетки, включая изменения в митохондриальной ДНК. Новый метод может позволить ученым изучить влияние соматических мутаций на огромное количество заболеваний.    Например, опухоли часто представляют собой мозаику генетических вариаций, поскольку различные клетки независимо друг от друга приобретают мутации, известные как субклональные мутации, которые делают опухоль более агрессивной. Улучшенное секвенирование ДНК отдельных клеток может помочь "выявить субклональные мутации, которые часто прячутся в раковых опухолях", - считает Кристофер Мейсон, биофизик из Weill Cornell Medicine в Нью-Йорке, который не принимал участия в исследовании.    Здоровые клетки также накапливают мутации на протяжении всей своей жизни, хотя это менее опасно для клеток кожи и кишечника, которые регулярно обновляются, чем для долгоживущих клеток нашего мозга. Но соматические мутации в нейронах и других клетках мозга могут влиять на работу мозга и способствовать развитию неврологических заболеваний, включая шизофрению, синдром Туретта и аутизм.    Константина Теофанопулу, научный сотрудник Хантер-колледжа, не принимавшая участия в исследовании, говорит, что ее исследования уже выиграли от достижений в области секвенирования ДНК. Длинные прочтения геномов позвоночных помогли ей раскрыть эволюционную историю рецепторов и лигандов, обеспечивающих социальную коммуникацию. Но, по ее словам, длинные прочтения, полученные из отдельных клеток, могут стать важнейшим инструментом для выявления генетических вариантов при речевых расстройствах, которые она изучает.    Однако техника не совершенна, признают исследователи. Несмотря на то, что амплификация на основе капель лучше, чем существующие методы масштабирования ДНК, она может приводить к ошибкам и образованию "химерных" образований, когда соседние части генома сцепляются друг с другом. Хотя в текущей работе им удалось выявить и удалить химеры, их строгий метод фильтрации также отбрасывает правильные прочтения. Исследователи работают над оптимизацией условий, чтобы уменьшить количество ошибок во время амплификации.    "Я рассматриваю это как доказательство принципа, где мы показываем, что все, что было сделано с длинными прочтениями в больших образцах, может быть сделано и на уровне одной клетки", - говорит Амер. "Теперь мы действительно можем изучать отдельные клетки более детально", - добавляет он.

Когда вы заболеваете гриппом, ваш организм сообщает вам об этом. У вас пропадает аппетит, вы чувствуете вялость и ухудшается настроение. Сама инфекция не вызывает этих симптомов - это делает ваш мозг.    Недавно ученые, возможно, выяснили ключевой момент в том, как это происходит. Исследуя мышей с гриппом, они обнаружили скопление нервных клеток в задней части гортани, которые определяют присутствие вируса и посылают сигналы в мозг, вызывая симптомы, реагирующие на инфекцию. Исследование является одним из первых, в котором эта реакция связывается с конкретной группой нервных клеток, говорит Анодж Иланж, биолог Медицинского института Говарда Хьюза, который не принимал участия в работе. "Они проделали действительно большую работу по всестороннему изучению этого вопроса".    Ученые знают, что плохое самочувствие во время болезни отчасти является результатом воздействия химических веществ, вырабатываемых инфицированными тканями. Некоторые из этих соединений, такие как простагландины, как известно, инициируют проявления недомогания. (Такие препараты, как ибупрофен, блокируют выработку простагландинов). Но остается неясным, как именно эти химические вещества взаимодействуют с мозгом, объясняет Стивен Либерлес, молекулярный нейробиолог из Гарвардской медицинской школы. "Удивительно мало известно о том, как мозг узнает, что в организме есть инфекция".    В новом исследовании Либерлес и коллеги сосредоточились на гриппе, который поражает дыхательные пути организма. Предыдущие исследования указывали на то, что один из видов простагландинов, вырабатываемых в ответ на вирусную инфекцию, называемый PGE2, может перемещаться по кровотоку и взаимодействовать с клетками мозга. Но когда исследователи инфицировали мышей, у которых генетически было создано отсутствие рецепторов для PGE2 в центральной нервной системе, животные все равно вели себя как больные - отказывались от еды и питья и двигались меньше обычного.    Это позволило предположить, что вместо этого PGE2 распознается периферической нервной системой, которая состоит из нейронов, расположенных вне головного и спинного мозга. Чтобы определить, где именно в организме происходит это обнаружение, группа объединила различные генетические инструменты для создания штаммов мышей с постепенно уменьшающимся набором рецепторов PGE2. В конце концов, они остановились на скоплении нейронов в задней части гортани, которая соединяет верхние дыхательные пути с мозгом. Мыши, лишенные рецепторов в этих клетках, не заболевали гриппом. Авторы работы добились того же эффекта у нормальных мышей, перерезав нервные волокна или дав животным ибупрофен.    Результаты исследования, опубликованные в журнале Nature, указывают на наличие особой системы обнаружения респираторных инфекций. Эта система может иметь несколько преимуществ, говорит Либерлес. Простагландины неустойчивы и могут не дойти до мозга через кровь, поэтому нейроны чувствуют их там, где они вырабатываются, что может быть более надежным. Эта система также предоставляет мозгу важную информацию о том, где находится инфекция, возможно, создавая специфическую реакцию, например, кашель.    Открытие этого периферического пути "пересматривает наше понимание того, как вирусная инфекция влияет на нервную систему, вызывая недомогание", - отмечает Элиа Таит Войно, иммунолог из Университета Вашингтона. Крошечные молекулы, такие как простагландины, "трудно изучать", - добавляет она, высоко оценивая использование исследователями "передовых генетических инструментов" для определения этого механизма.    Интересно, что блокирование пути PGE2 было менее эффективным для устранения болезненных проявлений на более поздних стадиях инфекции, отмечает Иланж. Возможно, это говорит о том, что другой механизм заставляет мышей испытывать недомогание, когда заболевание переходит из верхних дыхательных путей в легкие. Авторы также обнаружили, что отключение нейронов, распознающих PGE2, повышает шансы мышей на выживание. Это согласуется с результатами других исследований, показывающих, что блокирование синтеза PGE2 повышает выживаемость мышей с гриппом, но возникает вопрос, почему такой механизм развился вообще.    Одно из возможных объяснений: хотя заболевание делает мышей "более больными" гриппом, оно может защищать их от других инфекций. Например, некоторые исследования показывают, что мыши с бактериальным сепсисом имеют меньше шансов выжить, если они едят больше пищи - возможно, потому, что бактерии используют сахар в крови животного в качестве топлива. В этом случае потеря аппетита - это хорошо, говорит Либерлес. Или, возможно, это поведение развилось не потому, что оно помогает больным животным напрямую, а потому, что оно защищает их сородичей от инфекции, уменьшая социальные взаимодействия.    Неясно, передают ли нервные клетки гортани, распознающие простагландины, информацию о бактериях и вирусах, отличных от гриппа. "Будет очень важно [изучить] другие типы инфекции", - считает Иланж. Исследователи планируют сделать именно это, а также поискать нейроны, распознающие инфекцию, в других частях тела, например, в кишечнике.