Новости

Ученые объединили возможности геномных скринингов и машинного обучения, чтобы раскрыть секреты транскриптомной инженерии с помощью Cas13.    Редактирование генома с помощью технологий CRISPR быстро развивается, начиная с фундаментальных биологических исследований и заканчивая клиническими применениями. По мере того как генная терапия на основе Cas9 для лечения таких заболеваний, как серповидно-клеточная анемия, проходит путь к одобрению, многие ученые ищут методы, позволяющие вывести геномную инженерию на новый уровень. В частности, исследователи обращают внимание на инструменты для редактирования РНК, а не ДНК, что позволяет более точно контролировать экспрессию генов и напрямую воздействовать на некодирующие транскрипты ДНК.    Традиционные методы CRISPR-Cas9 основаны на использовании нуклеазы Cas9 и компонента направляющей РНК (gRNA), которая указывает нуклеазе путь к разрезанию комплементарных участков ДНК. К числу потенциальных препятствий, мешающих применению этой технологии, относятся такие факторы, как ненаправленное взаимодействие нуклеазы с нецелевой ДНК и ограниченное редактирование нужных целевых участков. Ученые проводят крупномасштабные скрининги на наличие целевых и нецелевых участков с помощью секвенирования следующего поколения, что помогает им создать более точные и эффективные технологии CRISPR.    "Десять лет назад было очень трудно думать о нацеливании на отдельные гены. А теперь, благодаря таким CRISPR-скринингам, мы можем делать это регулярно", - рассказывает Невилл Санджана, генетик из Нью-Йоркского университета, чья лаборатория разрабатывает технологии для изучения основ генетики заболеваний. Недавно исследовательская группа Санджаны изучала возможности нуклеазы Cas13, которая является РНК-редактирующей родственницей Cas9.    В работе, опубликованной в журнале Nature Biotechnology, Санджана и его коллеги из Колумбийского университета объединили возможности CRISPR-скрининга и глубинного обучения, чтобы определить правила, регулирующие Cas13-опосредованную транскриптомную инженерию. Исследователи разработали и протестировали около 200 000 Cas13 gRNA, нацеленных на основные гены в клетках человека. Они изучили как различные типы мутаций gRNA влияют на редактирование и создали обширный массив данных для обучения конволюционной нейронной сети, которую они назвали "Целевое ингибирование экспрессии генов с помощью дизайна gRNA" (TIGER). Исследователи использовали TIGER для прогнозирования эффективности и точности Cas13 gRNA.    TIGER позволил выявить, какие факторы необходимо учитывать при разработке жестко контролируемых систем РНК-редактирования, например, типы несовпадений мишеней и gRNA, которые оказывают наибольшее влияние на активность Cas13. Эти результаты открывают дорогу к следующему рубежу CRISPR-стратегий, позволяя исследователям модулировать степень редактирования, а не использовать редактирование генов как простое включение/выключение.    "Модуляция функции гена на 20%, 50% и 100% во многих случаях может дать разные результаты. Но одно из главных препятствий заключается в том, что сейчас у нас нет инструмента для точного управления снижением экспрессии генов", - пояснил Вей Ли, специалист по вычислительной биологии из Университета Джорджа Вашингтона, который не принимал участия в исследовании. "Если вы подумаете о регулировке громкости ваших колонок, то в большинстве случаев вы хотите точно отрегулировать ее так, чтобы вам было наиболее комфортно. Именно это они и сделали; я думаю, это действительно интересно".    Общая цель Санджаны в отношении TIGER и Cas13 выходит за рамки генной терапии и позволяет ответить на фундаментальный вопрос: как работает геном? Для достижения этой цели Cas13 обеспечивает дополнительный уровень контроля, которого лишены технологии Cas9; редактирование РНК позволяет исследователям напрямую изменять некодирующие РНК (нкРНК).    Для ученых, стремящихся раскрыть секреты генома, транскрипты нкРНК представляют собой большой фрагмент головоломки, потенциально играющий важнейшую роль в различных биологических процессах и заболеваниях. Хотя эта головоломка остается не до конца решенной, Санджана надеется восполнить пробелы с помощью технологии Cas13. "Когда мы разрабатывали эти CRISPR-скрининги, нацеленные на все гены в геноме, я все время думал: " А как насчет этих транскриптов", - рассказал он. "Было бы здорово, если бы мы могли сделать то же самое, воспользоваться преимуществами программируемости CRISPR, которая очень схожа между Cas13 и Cas9, и использовать ее для создания таких объединенных скринингов, где мы могли бы нацелиться не на тысячи генов, а на тысячи некодирующих РНК, чтобы действительно понять эту часть генома".

С появлением антибиотиков широкого спектра действия распространение бактерий с множественной лекарственной резистентностью, представленных грамотрицательными бактериями, постепенно превратилось в серьезную глобальную проблему здравоохранения.     В настоящее время карбапенемы остаются препаратами первой линии для лечения тяжелых грамотрицательных инфекций. Однако с увеличением интенсивности их использования во всем мире растет частота встречаемости и выявления карбапенем-резистентных Enterobacterales (CRE), карбапенем-резистентных Pseudomonas aeruginosa (CRPA) и карбапенем-резистентных Acinetobacter baumannii (CRAB), которые являются носителями карбапенемаз, инактивирующих большинство β-лактамных антибиотиков. Тем не менее из-за их ограниченного антимикробного действия побочные эффекты и резистентность, а также появление бактерий с широкой лекарственной резистентностью (XDR) и даже с полной панрезистентностью (PDR) побуждают нас к постоянному поиску новых вариантов антиинфекционных средств.    Препарат Цефтазидим-Авибактам (CAZ-AVI), состоящий из цефалоспорина третьего поколения Цефтазидима (CAZ) и нового ингибитора β-лактамаз Авибактама (AVI), эффективен в отношении ферментов класса А, класса С (AmpC) и некоторых ферментов класса D [например, Оксациллиназа (OXA)-48], при этом не обладает ингибирующей активностью в отношении металло-β-лактамазы-1 (NDM-1) класса В.     CAZ-AVI сохранял хорошую антибактериальную активность в отношении большинства видов Enterobacterales, включая AmpC, KPC и Enterobacterales, продуцирующих β-лактамазы расширенного спектра действия (ESBLs), однако антибактериальная активность в отношении Acinetobacter baumannii и Pseudomonas aeruginosa зависела от их чувствительности к CAZ. Препарат CAZ-AVI был одобрен Управлением по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств США (FDA) в феврале 2015 г. и Национальным управлением по медицинским изделиям США (NMPA) в мае 2019 г. для лечения осложненных инфекций мочевыводящих путей и осложненных внутрибрюшных инфекций, вызванных грамотрицательными бактериями с MDR или XDR.     Результаты систематической оценки свидетельствуют о том, что CAZ-AVI обладает положительным фармакологическим действием и потенциально может быть эмпирическим вариантом лечения тяжелых грамотрицательных бактериальных инфекций. Однако, поскольку большинство работ, посвященных этому вопросу, являются обсервационными, ситуационными или ретроспективными исследованиями с небольшим объемом выборки, клиническая эффективность и безопасность CAZ-AVI для лечения инфекций, вызванных CR-GNB, также заслуживают дальнейшего изучения.    Для расширения доказательной базы применения CAZ-AVI мы провели ретроспективный анализ клинических данных пациентов с инфекцией CR-GNB, изучили резистентность к CAZ-AVI и прогностические факторы риска, а также оценили эффективность и безопасность.    Цель: Изучить клиническую эффективность, безопасность и резистентность цефтазидима-авибактама (CAZ-AVI ) у пациентов с инфекциями, вызванными грамотрицательными бациллами, резистентными к карбапенемам (CR-GNB).    Методы: Мы ретроспективно проанализировали данные пациентов с CR-GNB-инфекциями, получавших лечение CAZ-AVI, проанализировали факторы, влияющие на эффективность препарата, и сравнили эффективность и безопасность с пациентами, получавшими лечение полимиксином В.    Результаты: Всего в исследование было включено 139 пациентов. Агранулоцитоз, септический шок, оценка по шкале SOFA и курс лечения препаратом CAZ-AVI были независимыми факторами риска, влияющими на прогноз пациентов с инфекцией CR-GNB, получавших лечение препаратом CAZ-AVI, в то время как продление курса лечения препаратом CAZ-AVI было единственным протективным фактором для бактериального клиренса.     Фундаментальные показатели не имели статистически значимых различий между группами лечения CAZ-AVI и полимиксином В. В то же время доля пациентов, получавших монотерапию, была достоверно выше в группе CAZ-AVI, чем в группе полимиксина В (37,2% против 8,9%), 30-дневная летальность в группе лечения CAZ-AVI (27,7% против 46,7%) была ниже, чем в группе лечения полимиксином В. Показатели 30-дневного клинического излечения (59,6% против 40%) и 14-дневного микробиологического клиренса (42,6% против 24,4%) были значительно выше в группе лечения CAZ-AVI, чем в группе лечения полимиксином В.    Восемьдесят девять пациентов были проконтролированы на предмет резистентности к CAZ-AVI, и общая частота резистентности составила 14,6% (13/89). Частота резистентности карбапенем-резистентной Klebsiella pneumoniae (CRKP) и карбапенем-резистентной Pseudomonas aeruginosa (CRPA) к CAZ-AVI составила 13,5 и 15,4% соответственно.    Выводы: Препарат CAZ-AVI показал высокую клиническую эффективность и бактериальный клиренс при лечении инфекций, вызванных CR-GNB. По сравнению с полимиксином В препарат CAZ-AVI значительно улучшил результаты применения искусственной вентиляции легких у пациентов с септическим шоком, агранулоцитозом, пациентов отделения интенсивной терапии, инфекцией кровотока и пациентов с баллом SOFA > 6, а также имел меньшую частоту нежелательных явлений. Мы наблюдали возникновение резистентности к CAZ-AVI, поэтому рекомендуем следует усилить мониторинг лекарственной чувствительности в клинической практике и рационально подбирать схемы приема антибиотиков, чтобы отсрочить возникновение резистентности.