Микробиом кишечника млекопитающих играет ключевую роль в поддержании стабильной физиологии кишечника и гомеостаза организма.
Роль отдельных видов бактерий в микробиоме кишечника человека изучается с начала 1900 годов и значительно ускорилась благодаря развитию технологии секвенирования с середины 2000-х годов. Накоплены доказательства того, что некоторые виды комменсалов играют полезную роль в поддержании здоровья хозяина, в то время как некоторые другие виды, называемые патобионтами, играют негативную роль.
Патобионты часто относятся к симбиотическим бактериям с патогенным потенциалом, которые способствуют прогрессированию заболевания, но еще не признаны патогенами. Например, Fusobacterium nucleatum, оральная симбиотическая бактерия, была признана проканцерогенной бактерией при колоректальном раке (CRC). Энтеротоксигенная Bacteroides fragilis (ETBF), которая ассоциируется с воспалительными заболеваниями кишечника и CRC у людей, способствует развитию колита и канцерогенеза в мышиных моделях (Chung et al., 2018; Cao et al., 2021). Было показано, что pks+ Escherichia coli, продуцирующая генотоксичный колибактерин, способствует развитию опухолевого генеза в мышиных моделях и у пациентов с CRC (Pleguezuelos-Manzano et al., 2020; Iftekhar et al., 2021).
При заболеваниях, вызванных патобионтами, они могут служить терапевтическими мишенями. Антибиотики являются первой линией при лечении бактериальной инфекции; однако лечение антибиотиками имеет множество побочных эффектов, включая вторичные инфекции, проблемы с пищеварением и появление антибиотикорезистентных бактерий. Поэтому существует большая потребность в инструментах, которые можно использовать для более точной модуляции микробиома. Такие средства сделали бы патобионтов "управляемыми", а связанные с ними заболевания - предотвратимыми с минимальными побочными эффектами.
В этом обзоре мы обобщили пять категорий целевых антимикробных препаратов, которые перспективны для разработки в качестве инструментов для модуляции микробиома кишечника с целью достижения благоприятного исхода для хозяина. Сначала мы рассмотрели антимикробные средства узкого спектра действия, созданные растениями и микроорганизмами, а затем более целевые антимикробные средства, включая синтетические антимикробные пептиды, фаги и системы адресной доставки лекарственных средств.
Антимикробные агенты узкого спектра действия из растений
Противомикробные агенты узкого спектра действия действуют на ограниченный круг бактерий, оставляя невредимыми широкий круг бактерий. Например, берберин, четвертичный аммониевый алкалоид из растений, включая золотарник китайский (Coptis chinensis Franch.), показал антимикробную активность в отношении Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Enterococcus faecium, Bacillus dysenteriae, Shigella flexneri и Helicobacter pylori и не показал антимикробной активности в отношении широкого спектра бактерий, охватывающих множество фил, включая Staphylococcus epidermidis, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter Baumanni, Enterobacter cloacae, Proteus mirabilis, Bifidobacterium longum и Lactobacillus casei (Lin Yuan and Jian-Dong, 2018). Неудивительно, что пероральный прием берберина привел к изменению микробиома хозяев. Интересно, что помимо изменения микробиома, берберин и его производные оказывали широкое воздействие на здоровье или прогрессирование заболеваний у хозяев, что указывает на связь между действием берберина и измененным микробиомом.
Хотя берберин иногда влияет на здоровье хозяина, непосредственно взаимодействуя с его мишенями, появляются новые доказательства того, что действие берберина опосредовано микробиомом кишечника. Например, берберин ослабляет атеросклероз, вызванный холином, в мышиной модели путем снижения уровня бактериального производства триметиламина, молекулы, способствующей развитию атеросклероза, вырабатываемой микробиомом кишечника (Li et al., 2021). В другой мышиной модели берберин смягчал вызванное овариэктомией тревожное поведение за счет обогащения микробиома кишечника (Fang et al., 2021a). Кроме того, исследование на человеке показало, что антидиабетический эффект берберина при диабете 2 типа опосредован ингибированием Ruminococcus bromii, который расщепляет тип вторичной желчной кислоты, способствующей гликемическому контролю (Zhang et al., 2020b).
Помимо берберина, полифенолы, тип соединений, производимых растениями, также показали антимикробную активность узкого спектра действия in vitro. Подобно берберину, пероральный прием полифенолов также оказывает благоприятное воздействие на многочисленные заболевания хозяина, изменяя при этом его микробиом кишечника. К таким заболеваниям относятся колоректальный рак, вызванный колитом, сердечно-сосудистые заболевания и ожирение (Gowd et al., 2019; Martinet et al., 2019; Jennings et al., 2021; Rufino et al., 2021; Zhao and Jiang, 2021). Учитывая накапливающиеся ассоциации между влиянием полифенолов на здоровье и модуляцией микробиома кишечника, вполне вероятно, что полезные эффекты полифенолов опосредуются микробиомом кишечника, хотя для выявления роли микробиома кишечника в этих эффектах требуются дальнейшие исследования.
В дополнение к таким определяющим ингредиентам, как берберин и полифенолы, некоторые растительные экстракты показали антибактериальную активность узкого спектра действия in vitro. Например, этаноловые экстракты Passiflora mollissima, богатые несколькими фитохимическими веществами, включая алкалоиды, сапонины, эфирные масла, каротиноиды и анксиолитики, показали селективную активность против культивируемых in vitro штаммов Streptococcus mutans, Streptococcus oralis и Streptococcus sanguiniss (Adrián Calderon et al., 2019), хотя их активные ингредиенты еще не известны.
Антимикробные агенты узкого спектра действия из микроорганизмов
Антимикробные пептиды (АМП) вырабатываются широким спектром организмов, включая микроорганизмы, растения, насекомых и позвоночных. АМП животных являются важными компонентами врожденной иммунной системы и часто обладают антимикробной активностью широкого спектра действия. В отличие от них, бактериальные АМП, называемые бактериоцинами, часто проявляют ограниченный спектр антимикробной активности, действуя на бактерии, филогенетически родственные бактериям-производителям бактериоцинов (Meade et al., 2020). Большинство бактериоцинов убивают бактерии-мишени путем образования пор на мембране жертв, другие механизмы включают гибель путем конденсации геномной ДНК или ингибирования синтеза клеточной стенки.
Бактериоцины в основном делятся на три класса на основе их структурных и физико-химических свойств: класс I, класс II и класс III. Бактериоцины класса I относятся к рибосомно синтезированным и посттрансляционно модифицированным пептидам (RiPPs). Они также известны как лантибиотики, поскольку содержат необычные аминокислоты, лантионин и метиллантионин. Бактериоцины класса I часто проявляют антимикробную активность широкого спектра действия.
Напротив, бактериоцины класса II представляют собой преимущественно немодифицированные пептиды и часто демонстрируют антимикробную активность узкого спектра действия (Moll et al., 1999; Ríos Colombo et al., 2019). Сначала они синтезируются как пребактериоцины с N-концевым лидером, а затем лидер удаляется в процессе секреции. Например, рамноцин 519 показал антибактериальную активность узкого спектра действия против Listeria monocytogenes и S. aureus (Jeong and Moon, 2015).
Бактериоцины класса III - это термолабильные антибактериальные белки с высокой молекулярной массой. Например, геобациллин 26 имеет узкий антибактериальный спектр против некоторых термофильных бактерий (Vaičikauskaitė et al., 2019). Для борьбы с патобионтами в кишечнике с минимальным побочным ущербом для нормальной флоры кишечника бактериоцины узкого спектра действия более благоприятны, чем бактериоцины широкого спектра действия.
Помимо бактериоцинов, многие грибы и бактерии выделяют антимикробные вторичные метаболиты. В отличие от многих антибиотиков широкого спектра действия, которые используются для профилактики инфекционных заболеваний, некоторые вторичные метаболиты проявляют избирательную антимикробную активность.
В отличие от берберина и полифенолов, влияние перорального приема антимикробных агентов, полученных из бактерий, на изменение микробиома хозяина изучено недостаточно, однако было бы интересно проверить эти антимикробные агенты узкого спектра действия из микроорганизмов как потенциальные инструменты для модуляции микробиома кишечника с целью достижения благоприятного воздействия на здоровье хозяина.
Синтетические антимикробные пептиды
Благодаря бактериоцинам с 1992 года появились синтетические АМП, содержащие только остатки лейцина и лизина. Область изучения синтетических АМП впервые была сосредоточена на изучении корреляции между структурными свойствами и антимикробной активностью АМП. За последнее десятилетие было установлено, что три основных параметра АМП играют роль в их антимикробной активности, а именно: (1) гидрофобность, (2) катионное число и (3) вторичная структура.
(1) Гидрофобность вносит вклад в мембраносвязывающую движущую силу, которая является основной причиной повреждения мембран клеток-мишеней. Гидрофобность часто задает антимикробную потенцию и клеточную селективность. Например, лейцин и более гидрофобный изолейцин являются изомерами. Их чередование не изменяет структуру пептида, но увеличивает гидрофобность. При увеличении гидрофобности антибактериальный спектр изменялся от только грамотрицательных до как грамотрицательных, так и грамположительных бактерий, демонстрируя, что гидрофобность является одним из ключевых параметров в определении селективности бактерий (Chou et al., 2016).
(2) Катионное число АМП определяется катионными остатками, такими как аргинин, лизин и гистидин, и катионное число определяет сродство АМП к отрицательно заряженным головным группам липидов на внешней мембране бактерий.
(3) Вторичные структуры АМП часто определяются ключевыми аминокислотами, включая цистин и глицин. Остатки цистеина, которые могут образовывать дисульфидные связи, являются предпосылкой для циклизации и β-листа (de Leeuw et al., 2007). Глицин, самая маленькая гидрофильная аминокислота, определяет гибкость локальной конформации АМП, что способствует усилению активности против грамотрицательных бактерий (Wang et al., 2015). Примечательно, что селективность АМП часто определяется тремя основными параметрами, упомянутыми выше, а также бактериальными факторами, что дает основание для разработки более целевых АМП, называемых специфически направленными антимикробными пептидами (STAMP).
В течение последнего десятилетия STAMPs изучались с целью уничтожения специфических патогенов, не затрагивая при этом нормальную флору. Будучи пептидами, STAMPs очень гибки в принятии структурных и функциональных аминокислотных групп (Roncevic et al., 2019), поэтому они могут достигать гораздо более узкого спектра, чем природные антимикробные агенты узкого спектра действия, рассмотренные выше. STAMPs можно разделить на три категории, которые, соответственно, рассмотрены ниже и проиллюстрированы на рисунке 2, на основе различных стратегий рационального проектирования.
Канонические STAMPs
Канонические STAMP убивают бактерии путем встраивания в поверхность клеточной стенки, последующего формирования пор самоолигомеризации и разрушения клеточной стенки. Селективность или антибиотический спектр STAMPs в основном определяется тремя основными параметрами. Чтобы лучше помочь в разработке STAMPs с желаемым антимикробным спектром, была разработана всеобъемлющая база данных АМП (Wang et al., 2009). На основе базы данных АМП было разработано множество STAMPs, включая STAMPs против E. coli, Salmonella pullorum, Pseudomonas aeruginosa и S. aureus (Mishra and Wang, 2012; Chou et al., 2019, 2021; Roncevic et al., 2019). В мышиной модели было продемонстрировано, что рН-зависимый STAMP уничтожает H. pylori в кислой среде желудка с минимальной токсичностью для комменсальных бактерий в кишечнике (Xiong et al., 2017).
Пептидные лиганды как STAMPs
Помимо стратегии конструирования на основе базы данных АМП, была разработана альтернативная стратегия конструирования. В рамках этой стратегии STAMP были получены путем усечения последовательностей природных белковых лигандов целевого бактериального рецептора, имеющего важное физиологическое значение. Полученный STAMP затем конкурентно ингибирует рецептор и его нисходящие пути. Например, последовательность STAMPs, связывающегося с F. nucleatum FadA, была укорочена от природного лиганда FadA - E-кадхерина млекопитающих (Rubinstein et al., 2013). Имитирующий E-кадхерин STAMP успешно ингибировал FadA-зависимую F. nucleatum-индуцированную опухоль и воспаление в мышиных моделях.
Композитные STAMPs
Третья стратегия конструирования STAMPs включает конъюгирование предварительно выбранного целевого пептида с доменом АМП широкого спектра действия, в результате чего получаются составные STAMPs с целевым доменом и киллинговым доменом. Например, бактериальные феромоны были использованы в качестве целевых доменов в STAMPs против S. mutans, S. aureus, Enterococcus faecalis и/или Streptococcus agalactiae (Qiu et al., 2003; Huo et al., 2018; Li et al., 2020; Xu et al., 2020). Кроме того, пептид, связывающий липид II предшественника клеточной стенки, отобранный из библиотеки фагов, был использован в качестве целевого домена в STAMP, который специфически уничтожал некоторые клинически изолированные штаммы бактерий, резистентные к ванкомицину (Hart et al., 2017).
Стратегии улучшения стабильности STAMPs в кишечнике
Хотя в двух клинических испытаниях АМП использовались для уничтожения специфических микроорганизмов в ротовой полости и желудке с минимальным воздействием на другие комменсальные бактерии (Sullivan et al., 2011; Xiong et al., 2017), нет сообщений о применении АМП, направленных на специфические бактерии в кишечнике и толстой кишке. Одной из проблем в использовании STAMPs является протеолитическая деградация STAMPs, которая происходит в пищеварительной системе.
Для повышения стабильности АМП в кишечнике было использовано несколько стратегий. Распространенной стратегией является нанесение покрытия. Например, АМП, предназначенный для лечения инфекции Clostridioides difficile, покрыт слоем пектина и гидроксипропилметилцеллюлозы, которые могут защитить АМП от протеолитических ферментов кишечных пищеварительных ферментов и высвободить АМП при встрече с пектинолитическими ферментами в толстой кишке (Ugurlu et al., 2007).
Другая стратегия заключается в разработке STAMPs, способных самособираться в наноразмерные частицы, которые демонстрируют высокую стабильность против ферментативной деградации (Eskandari et al., 2017; Chen and Zou, 2019; Tan et al., 2021). Кроме того, для повышения протеолитической стабильности применяют введение D-аминокислот, циклизацию, амидирование или ацетилирование терминальных областей (Dijksteel et al., 2021).
Использование бактериофагов естественного происхождения
Бактериофаги присоединяются к специфическим рецепторам на поверхности бактерий, таким как липополисахарид, липотейхоевая кислота, капсульный полисахарид, жгутики и пили, прежде чем уничтожить их, и поэтому являются высоконаправленными антимикробными агентами. Фаги исторически использовались для уничтожения бактериальных патогенов и недавно были использованы в качестве потенциальной стратегии лечения заболеваний путем прецизионного уничтожения бактерий-мишеней (Mccarville et al., 2016; Wahida et al., 2021; Zhang et al., 2021). Например, Duan et al. сообщили, что бактериофаг, нацеленный на цитолитический E. faecalis, снижает уровень цитолизина в печени и устраняет вызванное этанолом заболевание печени у мышей (Duan et al., 2019; Colakoglu et al., 2020).
Фаг настолько избирателен в отношении мишеней, что штамм фага обычно эффективен только в отношении одного штамма бактериального вида; однако смесь нескольких штаммов фагов, называемая фаговым коктейлем, позволяет достичь желаемого спектра фаговой терапии. Например, оптимизированный 4-фаговый коктейль против Clostridium difficile уничтожил C. difficile за 24 часа, не затрагивая комменсальные микробы кишечника (Nale et al., 2018).
Помимо использования фагов самих по себе, фаги использовались в качестве основы для синтеза управляемых фагами противомикробных препаратов. Например, антибиотик линезолид, конъюгированный с литическим фагом, был более эффективен, чем каждая часть в отдельности, при лечении MRSA-инфекций диабетических язв стопы в мышиной модели инфекции S. aureus (Chhibber et al., 2013). Фаг также использовался в качестве направляющей наночастиц серебра для воздействия на F. nucleatum (Xue Dong et al., 2020).
Система адресной доставки лекарственных средств
Концепция системы адресной доставки лекарств часто используется в противораковых препаратах. Система адресной доставки лекарств обычно состоит из целевого блока и грузового блока. Целевые единицы обеспечивают высокую эффективность связывания лигандов с целевыми тканями или клетками, а грузовые единицы - это биологически активные препараты, иногда загруженные в такие транспортные средства, как наночастицы и липосомы.
В последнее время система адресной доставки препаратов также используется в области специфических противомикробных средств. В одном из последних исследований была разработана внутриклеточная система доставки антибиотиков. Система доставки состоит из трех частей: (1) наночастиц мезопористого кремнезема, нагруженных гентамицином, (2) липидных двухслойных оболочек, которые разрушаются при контакте с гемолизинами S. aureus, и (3) домена, нацеленного на S. aureus, вырезанного из ранее обнаруженного АМП, убиквицидина 29-41. Эта система доставки хорошо уничтожает S. aureus и устраняет воспаление, вызванное S. aureus, в мышиной модели (Yang et al., 2018). В другой системе доставки лекарств липидные наночастицы, нагруженные антибиотиком, были конъюгированы с антителами, нацеленными на S. aureus. Полученная система продемонстрировала повышенную бактерицидную активность in vitro против S. aureus как в планктонных, так и в биопленочных формах (Le et al., 2021).
За последнее десятилетие знания об антимикробных препаратах узкого спектра действия значительно расширились. Примечательно, что некоторые антимикробные препараты узкого спектра действия поступили в клинические испытания, в основном для борьбы с бактериями, ассоциированными с антибиотикорезистентностью, такими как Acinetobacter baumannii, S. aureus, P. aeruginosa и E. coli. В этой статье мы рассмотрели антимикробные препараты узкого спектра действия с точки зрения их использования в качестве инструмента для модуляции микробиома, особенно для ограничения патобионтов в кишечнике.
Среди всех природных антибиотиков узкого спектра действия берберин наиболее хорошо изучен с точки зрения его влияния на здоровье хозяина и изменение микробиома кишечника. Хотя ключевые патобионты многих заболеваний не определены, появляются новые доказательства того, что благоприятное воздействие берберина на здоровье опосредовано модуляцией микробиома кишечника, что позволяет предположить существование скрытых патобионтов при этих заболеваниях. Помимо берберина, существует множество других антибиотических агентов узкого спектра действия, естественно производимых растениями и бактериями, которые могут служить инструментами для модуляции микробиома кишечника хозяина. Было бы интересно исследовать их влияние на здоровье хозяина и роль веерных изменений микробиома в этих эффектах.
Среди пяти категорий антимикробных агентов, рассмотренных в этой статье, STAMPs, фаги и системы адресной доставки препаратов могут быть разработаны для точного воздействия на этих патобионтов без нарушения нормальной флоры кишечника. Эти стратегии обладают потенциалом для достижения более высокого уровня точности воздействия на бактерии-мишени, чем естественные антимикробные агенты узкого спектра действия.
Помимо стратегий, рассмотренных в этой статье, пробиотические и инженерные бактерии также были изучены для модуляции микробиома кишечника. Влияние пробиотиков на микробиом кишечника подробно рассмотрено, а инженерные бактерии - сложная тема. При конструировании таких инженерных бактерий необходимо учитывать множество факторов, включая выбор бактерий-шасси, схем управления, стратегий секреции и белков полезной нагрузки.
Для таргетной терапии патобионтов обнаружение патобионтов является сложной задачей. Одним из лучших методов обнаружения патобионтов является qPCR против их "факторов вирулентности". Например, обнаружение энтеротоксигенных бактерий Bacteroides fragilis (ETBF) может быть основано на qPCR токсина B. fragilis (BFT) или фрагилизина. Таким образом, понимание патогенности патобионтов имеет решающее значение для разработки методов их обнаружения. Это отличается от классических патогенов, в которых полное понимание патогенности часто не требуется для разработки методов их обнаружения.
В заключение, учитывая новые открытия в области патобионтов и их патогенеза, мы ожидаем, что по мере расширения наших знаний о микробиоме человека появятся целевые антимикробные агенты в качестве нового поколения средств для лечения заболеваний, ассоциированных с микробиомом.
