Новости

Неожиданную модель предложил ученый ФИЦ Биотехнологии РАН.     Автор научного обзора сравнил извлечение звуков музыкальным инструментом с процессом синтеза грибами биологически активных соединений. Модель регуляции вторичного метаболизма по принципу фортепиано просто и наглядно объясняет механизм активации биосинтетических кластеров генов, приводящий к биосинтезу соответствующих вторичных метаболитов, а также указывает на способы повышения продуктивности высокоактивных штаммов. Результаты исследования опубликованы в журнале International Journal of Molecular Sciences.    Мицелиальные грибы, тело которых (мицелий) напоминает скопление тонких переплетающихся нитей, широко используются в биотехнологии для производства лекарственных препаратов, например антибиотиков, статинов, иммунодепрессантов. Отдельные виды этих грибов способны синтезировать более ста подобных биологически активных соединений, называемых вторичными метаболитами. Однако в конкретный период жизнедеятельности синтезируются лишь некоторые из этих веществ. Это зависит как от этапа развития микроорганизма, так и от условий внешней среды. Синтез различных вторичных метаболитов контролируется «включением» и «выключением» соответствующих генов в ответ на внутренние или внешние сигналы.    У мицелиальных грибов были обнаружены целые кластеры генов, контролирующие синтез вторичных метаболитов. Зная принципы, по которым эти гены активируются и подавляются, ученые предпринимают попытки управлять способностью грибов синтезировать важные для биотехнологии и медицины соединения и тем самым улучшать штаммы-продуценты. За последние десятилетия исследователи со всего мира накопили колоссальный объем информации о синтезе вторичных метаболитов у грибов. В связи с этим существует необходимость в обобщении всех данных и создании модели, способной наиболее просто и полно их описать.    Александр Жгун, к.б.н., руководитель группы генетической инженерии грибов ФИЦ Биотехнологии РАН, на основе классификации вторичных метаболитов грибов, их генных кластеров и иерархической системы регуляции предложил модель, обобщающую множество сложных процессов, происходящих в клетках мицелиальных грибов при синтезе вторичных метаболитов. Поскольку синтез любого из этих соединений «запускается» в ответ на некий сигнал, ученый сравнил его с принципом работы фортепиано, которое издает определенный звук в ответ на нажатие той или иной клавиши. «Внутри каждой грибной клетки как бы спрятан музыкальный инструмент, своеобразное фортепиано, которое позволяет при нажатии на определенную клавишу - активации генного кластера - издавать конкретный звук - продуцировать целевой вторичный метаболит», - рассказывает Александр Жгун.    Так, согласно предложенной модели, когда из внешней среды не поступает никаких сигналов, гены, отвечающие за синтез вторичных метаболитов, неактивны и находятся в состоянии так называемого гетерохроматина — плотно упакованных участков ДНК. Ферменты, начинающие синтез, не могут приблизиться к таким участкам, и это можно сравнить с тем случаем, когда крышка клавиатуры фортепиано закрыта, а пюпитр для нот опущен. Подобно тому, как музыкант не может извлечь звуки из закрытого инструмента, грибная клетка не будет способна синтезировать вторичные метаболиты.    Для того чтобы запустить синтез, гены переводятся в состояние, доступное для регуляторных белков и белков аппарата транскрипции. В этом случае участок ДНК с необходимом кластером генов перестает быть плотно упакованной и переходит в состояние эухроматина. По аналогии, когда фортепиано подготовлено к работе, музыкант может нажимать на клавиши, что приводит к возникновению звуков. При этом в представленной модели каждая клавиша соответствует отдельному биосинтетическому кластеру генов, активация которого приводит к синтезу определенного низкомолекулярного соединения.    Интересно, что автор научного обзора с помощью своей модели объясняет и тот факт, что внешние сигналы, на которые реагируют мицелиальные грибы, могут различаться по интенсивности. «Подобно тому, как, нажимая по-разному на одну и ту же клавишу фортепиано, музыкант может получить разный по продолжительности, громкости и характеру затухания звук, микроорганизмы могут регулировать количество синтезируемого ими соединения. Естественно, в живых клетках эта зависимость более сложная и далеко не всегда линейная, что объясняется комплексной и иерархической системой регуляции, координирующей реакции метаболизма», - поясняет автор статьи.    Чтобы сделать модель еще нагляднее и точнее, ученый предложил сравнивать регуляцию синтеза вторичных метаболитов с более сложным музыкальным инструментом — органом, который имеет несколько рядов клавиш — клавиатур. Эта аналогия представилась исследователю более корректной, потому что мицелиальные грибы имеют обычно не одну (как один ряд клавиш у фортепиано), а несколько (от двух до нескольких десятков) хромосом. Соответственно, активацию генов, отвечающих за синтез вторичных метаболитов и расположенных на разных хромосомах, можно сравнить с нажатием клавиш на разных клавиатурах органа.    «Для того чтобы проиллюстрировать работу модели на примере органа, я использовал знания о расположении биосинтетических кластеров генов у модельного организма Penicillium chrysogenum. Этот организм, используемый в биотехнологии для продукции важнейшего для человечества антибиотика - пенициллина G. У P. Chrysogenum, 4 хромосомы, следовательно, его «орган» содержит 4 клавиатуры. На этих клавиатурах для многих кластеров не обозначены соответствующие им соединения, потому что даже для модельных грибных организмов продукты многих кластеров до сих пор не известны. Поэтому чтобы заставить «музыкальный инструмент» грибной клетки издать некоторые звуки, требуются значительные усилия со стороны ученых», - рассказывает Александр Александрович.    Модель фортепиано также позволяет объяснить, каким образом можно «заставить» гриб производить нужное человеку соединение в очень больших количествах. В норме у микроорганизмов есть особые «молекулярные ограничители», которые не позволяют им синтезировать избыточное количество продукта. Так же и у исправного фортепиано существует ограничение по силе и продолжительности звука, который возникает при нажатии той или иной клавиши. Однако если повредить инструмент, можно добиться того, чтобы осталась только одна интересующая клавиша и она звучала постоянно и очень громко.    «В случае мицелиальных грибов такие нарушения можно осуществить с помощью изменений в системе регуляции вторичного метаболизма и биосинтетических кластерах, ответственных за продукцию альтернативных (примесных) вторичных метаболитов. В биотехнологии такие нарушения обнаружили в штаммах-продуцентах, полученных на протяжении последних 70-ти лет в результате случайного мутагенеза. Они позволяют в больших количествах получать антибиотики и другие вторичные метаболиты, используемые в медицине и промышленности», - рассказывает Александр Жгун.    Предложенная ученым модель предлагает новый взгляд на принципы регуляции вторичного метаболизма у мицелиальных грибов. Она позволяет лучше понять, как человек может искусственно управлять активностью генов и продуктивностью микроорганизмов. Благодаря этому изложенные в работе принципы представляют практический интерес для биотехнологии.

Джессика Сачер работает над созданием методов фаговой терапии, направленных на преодоление резистентности к противомикробным препаратам.    В 2017 году Джессика Сачер создавала производственную линию Phage Australia для терапевтических бактериофагов в Институте медицинских исследований Westmead в Сиднее, когда получила срочный запрос на фаг для лечения пациента в Питтсбурге (штат Пенсильвания) со смертельной легочной инфекцией. Этот случай заставил Сачер понять, что для улучшения доступа к новым фаговым препаратам необходимо наладить более тесную связь между исследователями и практикующими врачами. Она рассказала изданию Nature о том, почему исследования фагов важны и как инициатива Phage Directory, одним из основателей которой она является, помогает перенести этот метод из лаборатории в клинику.    Последний новый антибиотик нового класса, даптомицин, был открыт в конце 1980-х годов - таким образом, резистентность растет, а у ученых по-прежнему нет "серебряной пули". Фармацевтические компании не имеют финансовых стимулов для разработки антибиотиков, что требует дорогостоящих инвестиций с низкой отдачей. Альтернативным вариантом лечения бактериальных инфекций, резистентных к антибиотикам, является фаговая терапия. Она набирает обороты.    Фаги и бактерии участвуют в эволюционной гонке вооружений. Бактерии развивают различные механизмы, чтобы избежать заражения фагами, а фаги эволюционируют, чтобы обойти эти защитные механизмы бактерий, и поэтому теоретически могут быть использованы для уничтожения бактериальных инфекций в организме. Фаги могут быть выделены путем суспендирования образца сточных вод, воды, почвы или даже биологических жидкостей в буфере, благоприятном для фагов, и последующей фильтрации более крупных клеток. Этот процесс называется подготовкой фагов.    Однако идея использования фагов для лечения людей пока является экспериментальной. Пока не существует стандартизированного протокола контроля качества приготовления фагов или определения их количества для пациента, над чем и работает моя лаборатория. Фаг может вводиться так же, как и антибиотик: перорально, внутривенно, местно или непосредственно в легкие через небулайзер, в зависимости от места локализации инфекции.    Впервые идея использования фагов для лечения бактериальных инфекций была предложена в конце 1910-х годов Феликсом Д'Эреллем, франко-канадским микробиологом-самоучкой, работавшим волонтером в Институте Пастера в Париже. Во время Первой и Второй мировых войн фаговая терапия утратила свою актуальность. Антибиотики, напротив, можно было производить в больших масштабах и удобно вводить, к тому же они были эффективны против широкого спектра бактерий. Несмотря на это, в некоторых странах исследования фагов продолжались. В Грузии и Польше сегодня существуют медицинские центры, занимающиеся фаговой терапией, хотя она по-прежнему остается крайней мерой. В таких странах, как США и Австралия, а также в Западной Европе фаговая терапия применяется только по соображениям сострадания, когда пациенты уже не реагируют ни на какие антибиотики.     Бельгия, США и Австралия становятся лидерами по внедрению фаговой терапии в медицину. Мелкие и средние биотехнологические стартапы по всему миру также возглавляют программы, направленные на приближение фаговой терапии к клинике. Некоторые идеи включают коктейли фагов, способные воздействовать одновременно на несколько штаммов бактерий; фаги, генетически модифицированные с помощью CRISPR для повышения эффективности или избирательности в отношении патогенных видов бактерий; скрининг большой библиотеки фагов и выявление тех, которые способны уничтожать вредные бактерии.    На мой взгляд, в фаговой терапии существуют две основные проблемы. Во-первых, фаговая терапия не вписывается в модель современной медицины: данный фаг убивает только ограниченное число штаммов бактерий, которые, как правило, принадлежат к одному виду. Это ограничение затрудняет проведение и валидацию исследований, поскольку трудно найти достаточное количество людей, инфицированных одним и тем же штаммом бактерий, чтобы протестировать препарат. Таким образом, фаговая терапия является очень персонализированной - и очень дорогой.    Вторая серьезная проблема - доступность фагов. Существует множество врачей, желающих применять фаговую терапию по принципу сострадания, но, как правило, они либо не имеют доступа к инфраструктуре для производства фагов, либо не могут производить их с безопасным для использования качеством. Для использования по медицинским показаниям требования к фаговым препаратам зачастую более мягкие. Однако все равно необходимо проводить контроль качества, например, проверять низкий уровень содержания в фагах эндотоксинов - компонентов клеточной стенки бактерий, которые вызывают у человека иммунный ответ, приводящий к анафилактическому шоку и даже смерти.    В 2017 году мы с моим соучредителем Яном Чженгом создали Phage Directory для поддержки врачей, ищущих фаги. С тех пор мы разработали справочник для размещения запросов или "оповещений" о фагах против различных штаммов бактерий. В среднем мы получаем один такой запрос в неделю и 84% из разосланных нами оповещений получили ответ, например, обмен фагами или направление запрашивающих в лаборатории с соответствующими фагами. Запросы могут поступать от кого угодно. Как правило, они поступают от пациентов, но мы публикуем оповещения только в тех случаях, когда запросы поступают от врачей. После этого лаборатории и заказчики, как правило, заключают соглашение о передаче материалов, и лаборатории отправляют фаги заказчикам.    Благодаря Phage Directory мы получили невероятные истории успеха, например, 7-летняя девочка из Сиднея, ампутация ноги которой была предотвращена в 2019 году благодаря 12 лабораториям из нашей сети, предложившим помощь в предоставлении и очистке фагов. Однако вскоре мы поняли, что такой подход не является надежным - неожиданное получение сотен фагов для своего пациента ставит перед лечащей командой новые задачи. Нам нужны были более эффективные способы поддержки врачей и исследователей. За последние несколько лет мы составили список исследователей, академических лабораторий, компаний и центров фаговой терапии по всему миру, работающих с фагами, а также список их коллекций фагов и бактериальных мишеней. Наша задача - ускорить изучение и использование фагов в научных исследованиях и терапии.    Опыт создания Phage Directory помог мне понять силу создания сообществ, ориентированных на действия, особенно для небольших исследовательских областей. В мире насчитывается всего несколько сотен лабораторий, работающих с фагами, и это число меркнет по сравнению с сотнями и тысячами лабораторий, занимающихся такими заболеваниями, как рак и диабет, а ведь, по данным Всемирной организации здравоохранения, резистентность к противомикробным препаратам является одной из десяти главных глобальных угроз человеческому здоровью. Объединение фагового сообщества для обмена передовым опытом и ресурсами уже позволило небольшой группе активных исследователей добиться значительных успехов, и дальнейшее использование этих возможностей поможет нам реализовать клинический потенциал фаговой терапии.