Новости

Метагеномное секвенирование может помочь обнаружить неизвестные патогены, но его широкое использование сталкивается с трудностями.    18 декабря 2019 года можно считать днем начала пандемии Covid-19. Именно в этот день в центральную больницу Ухани поступил пациент с симптомами, характерными для зимнего сезона гриппа: 65-летний мужчина с высокой температурой и пневмонией. Ай Фен, директриса отделения неотложной помощи, назначила стандартное лечение, включающее антибиотики и противогриппозные препараты.    Согласно новостным сообщениям и подробной реконструкции этого периода пандемии эволюционным биологом Майклом Уороби, шесть дней спустя пациент все еще болел, и Ай была озадачена. Сотрудники респираторного отделения решили попытаться определить виновного возбудителя путем секвенирования. 27 декабря больница получила результаты: мужчина заразился новым коронавирусом, близкородственным тому, который вызвал вспышку атипичной пневмонии, начавшуюся 17 лет назад.    Тогда вирус SARS был секвенирован только через пять месяцев после того, как были зарегистрированы первые случаи заболевания. В то время использовалось традиционное секвенирование, когда считывается геном только одного организма за раз, который сначала необходимо тщательно выделить из образца. В 2019 году исследователи, нанятые центральной больницей Ухани, смогли очень быстро составить карту нового вируса с помощью более сложного метода, называемого метагеномным секвенированием, который считывает геномы всех организмов в образце сразу, без такой длительной подготовки. Если традиционный подход похож на поиск одной книги на полке и ее копирование, то метагеномное секвенирование похоже на схватывание всех книг с полки и их одновременное сканирование.    Эта способность быстро считывать целый ряд геномов оказалась полезной в самых разных областях - от экологии до лечения рака. А пандемия COVID-19 подтолкнула некоторых исследователей к использованию метагеномики для выявления новых заболеваний и реагирования на них на ранних стадиях - до того, как они станут эпидемиями а возможно, и до заражения людей. Однако, несмотря на очевидную силу метагеномики, существуют проблемы с ее использованием для реагирования на потенциальные пандемии. Этот метод требует интенсивной компьютерной обработки, что делает его более дорогостоящим, чем некоторые другие, и требует больших знаний для интерпретации результатов. Использование большого количества данных, полученных с помощью метагеномики, для руководства лечением также ставит под сомнение принятие медицинских решений, когда, например, неясно, вызывает ли определенный патоген конкретное заболевание.    Тем не менее, защитники метода утверждают, что затраты того стоят. "Метагеномика играет важнейшую роль в обеспечении готовности к пандемии, поскольку позволяет искать то, что мы не знаем, как искать", - говорит Джессика Мэннинг, исследователь инфекционных заболеваний из Национального института аллергии и инфекционных заболеваний США. Метагеномное секвенирование быстро стало незаменимым в некоторых областях, особенно там, где исследователи изучают сочетание микроорганизмов в окружающей среде. "Количество секвенированных вирусов просто зашкаливает", - утверждает Эдвард Холмс, эксперт по патогенам из Сиднейского университета. "В прежние времена вирусы культивировали и секвенировали по одному. Теперь этого нет. Теперь это просто метагеномика".    В медицине метагеномика может помочь объяснить заболевания, которые не выявляются более обычными тестами, такими как тесты на грипп или стрептококк. Именно так Ай Фен и ее коллеги из центральной больницы Ухани обнаружили одни из первых доказательств существования нового коронавируса. Но исследователи также используют метагеномику более целенаправленно, чтобы попытаться обнаружить вспышки на ранних стадиях и, возможно, предотвратить очередную пандемию. Один из очевидных потенциальных рисков исходит от коронавирусов, которые уже вызвали две новые крупные эпидемии у людей в этом веке. Использование метагеномики в качестве инструмента для выяснения того, как вирусы перемещаются между животными в Азии, может дать исследователям раннее предупреждение о развитии новых человеческих патогенов.     Например, в 2021 году исследователи в Камбодже провели метагеномное секвенирование образцов местных летучих мышей и обнаружили два ближайших известных родственника SARS-CoV-2. В 2019 году группа в Китае, используя тот же подход, обнаружила, что панголины переносят аналогичные вирусы и могут быть их переносчиками человеку. А Чжэн-Ли Ши, который нашел вероятное место рождения атипичной пневмонии и возглавил Уханьский институт вирусологии, объявивший о SARS-CoV-2, использовал метагеномику для составления карты вирусов у летучих мышей.    Исследователи также используют метагеномику для поиска патогенов в других частях света. Кара Брук, эволюционный биолог из Чикагского университета, руководит таким проектом на Мадагаскаре, который, по ее словам, является именно тем местом, где могут появиться новые заболевания - тропическая страна с ограниченным медицинским обслуживанием, где обитают летучие мыши, переносящие человеческие патогены, такие как вирус Эбола. Более того, люди на Мадагаскаре едят некоторых крупных летучих мышей, что создает благоприятные условия для распространения вирусов.   В ноябре 2022 года Брук вместе с четырьмя аспирантами отправилась в джунгли Мадагаскара, чтобы взять образцы трех видов летучих мышей. Самая крупная из них, Pteropus rufus, может иметь размах крыльев около трех футов и представляет собой внушительную добычу. "Масса грудных мышц впечатляет", - говорит Брук. "Это как стейк".    Недавно Брук поймала летучую мышь, которую ее команда отловила и пометила еще в 2013 году. Летучие мыши могут жить до 40 лет, намного дольше, чем другие млекопитающие аналогичного размера. Считается, что, будучи единственными летающими млекопитающими, они развили уникальные особенности своей иммунной системы, которые объясняют как их долголетие, так и то, почему они переносят так много вирусов. Это, в свою очередь, может быть причиной того, что летучие мыши являются источником многих человеческих болезней.    В 2022 году Брук и ее коллеги сообщили о последовательностях двух новых коронавирусов в журнале Frontiers in Public Health. Согласно статье, эти вирусы не представляют угрозы для людей, но знание их родословной может помочь исследователям лучше понять, как коронавирусы эволюционируют в патогенные разновидности. Брук также проводит секвенирование образцов людей на Мадагаскаре, страдающих необъяснимыми лихорадками, чтобы выяснить, может ли она обнаружить новые патогены, которые уже перешли от других животных.    Другие группы также занимаются поиском таких перекрестных связей. Например, в 2018 году группа исследователей организовала эпид.надзорную программу в трех больницах Китая, используя метагеномное секвенирование для тестирования людей с лихорадкой и недавним контактом с животными. В течение следующих трех лет они обнаружили 35 человек, заболевших ранее неизвестным вирусом, который они описали в журнале New England Journal of Medicine в августе 2022 года. Исследователи также проверили животных вблизи домов пациентов и обнаружили вирус у коз, собак, мышей, одной неудачливой полевки и чаще всего у землероек, которые, как подозревают исследователи, являются его природными резервуарами. Никто из пациентов не умер, и исследователи заявили, что вирус, скорее всего, не распространяется между людьми. Но если вирус эволюционирует и станет более опасным, медики теперь могут быть лучше подготовлены к этому.    Многие исследователи уверены, что метагеномика должна играть более важную роль в наблюдении за вспышками. Александр Гренингер, микробиолог из Университета Вашингтона, считает, что наиболее очевидным способом использования этой методики является тестирование людей, умерших без объяснения причин. "Для диагностики важно знать, что именно мы упустили", - говорит Гренингер.  "Ведь это как канарейка в угольной шахте".    Но существуют препятствия для повседневного использования. Ключевая организационная проблема, например, американского здравоохранения заключается в том, что страховщики обычно платят за традиционные тесты для диагностики одного заболевания, а не за тесты, которые выявляют множество заболеваний, как метагеномное секвенирование. "Тем не менее, метагеномика - это отличный способ создать радар раннего предупреждения", - считает Гренингер. В будущем, по его словам, врачи и ученые смогут регулярно использовать эту технологию для выявления как новых, так и старых заболеваний. Следующее поколение метагеномного секвенирования, наряду с достижениями в смежных технологиях, добавил он, "будет использоваться для замены многих основных диагностических систем, которые мы имеем сегодня для инфекционных заболеваний".    У метагеномики есть свои недостатки. Одним из них является цена: секвенирование стоит дороже, чем экспресс-тесты, особенно учитывая, что большинство метагеномных анализов людей обнаруживают относительно небольшое количество распространенных патогенов, что не очень ценно, пояснил Гренингер. В Китае стоимость секвенирования ниже, в основном потому, что компании там проводят секвенирование большого количества образцов, что дает им значительную экономию за счет масштаба.    Исследователи также отмечают, что многие успехи метагеномных исследований - это отчеты о случаях обнаружения новых или неожиданных патогенов у небольшого числа людей. Сложнее показать, как этот инструмент должен применяться систематически в рамках системы здравоохранения - при каких обстоятельствах, например, тестировать пациента, и как действовать в случае неоднозначных результатов. По словам Гренингера, в этой области есть энтузиасты, которые продвигают метагеномику как яркую технологию больших данных, преуменьшая при этом сложности. "Академики занимаются тем, что продают будущее", - говорит он.    Помимо этих финансовых и медицинских препятствий, более серьезные проблемы могут возникнуть из-за политики: даже если бы этот метод получил широкое распространение, правительства должны делиться информацией, чтобы она была полезной. Споры о происхождении COVID "стали настолько ожесточенными, что теперь люди менее склонны к сотрудничеству", - говорит Холмс. "Если в Китае появилась новая инфекция, думаю ли я, что китайское правительство разрешит проведение исследований? Ни в коем случае. Сейчас мы находимся в худшей ситуации, чем до пандемии".     Даже когда метагеномика была использована для быстрого выявления SARS-CoV-2, она столкнулась с политической реальностью. В центральной больнице Ухани в 2019 году, после того как Ай Фен узнала, что ее пациент является носителем нового коронавируса, она обвела красным кружком соответствующий текст в своем письменном отчете, сфотографировала документ и отправила его в групповой чат с другими врачами в Ухани. Вскоре она получила строгий выговор от дисциплинарного комитета больницы за "распространение слухов" и "нанесение ущерба стабильности". Китайские чиновники затыкали рот врачам в Ухани, используя свою власть, чтобы остановить распространение неудобной правды. Ай никак не могла предположить, насколько дорого обойдется эта задержка.     "Если бы я знала, что это произойдет сегодня, - сказала она в интервью китайскому журналу People, - я бы не обращала внимания на все выговоры и критику и выступала бы везде".

40-летняя женщина поступила с одышкой при нагрузке, потерей веса и слабостью.     УЗИ сердца показало эндокардит аортального клапана с легким утолщением аортального клапана, вегетациями и тяжелой аортальной регургитацией без стеноза. Пациентка была доставлена в операционную для замены клапана. Биопсия ткани была отправлена на хирургическое патологоанатомическое исследование и микробиологические культуры. Гистология правого и левого коронарных стволов и некоронарных стволов показала очаговую гигантоклеточную реакцию и острую воспаленную грануляционную ткань, соответствующую вегетативному/инфекционному эндокардиту.     При окрашивании по Граму образца ткани были обнаружены грамположительные кокки, но роста бактерий не наблюдалось. Культуры грибков и микобактерий также были отрицательными. ПЦР и секвенирование (BRBPS) выявили Streptococcus mutans. Очаговая гигантоклеточная реакция (черная стрелка) и резкое воспаление грануляционной ткани, соответствующее вегетативному/инфекционному эндокардиту (левое изображение). Окраска по Граму образца ткани выявила грамположительные кокки (правое изображение). Обсуждение    BRBPS (Broad Range Bacterial PCR and Sequencing) - это комбинированная методика, сочетающая ПЦР и секвенирование. Первый этап BRBPS - проведение ПЦР, направленной на 16S рибосомальную РНК (рРНК), консервативный ген многих видов бактерий, включая микобактерии. Если ПЦР отрицательная, то секвенирование не проводится, но если ПЦР положительная, то проводится секвенирование, например, секвенирование по Сэнгеру или секвенирование следующего поколения. Последующий биоинформационный анализ результатов секвенирования позволит идентифицировать конкретную бактерию. У данной пациентки ПЦР на 16S рРНК была положительной, а секвенирование выявило S. mutans.    S. mutans относится к вириданс-группе стрептококков и может быть идентифицирована как грамположительная кокковая палочка с альфа-гемолитическим ростом, устойчивая к оптохину и нерастворимая в желчи. Стрептококки группы Viridans проникают в кровоток после стоматологического лечения или стоматологических процедур и могут быть связаны с высоким риском развития инфекционного эндокардита у пациентов с основными заболеваниями сердца.     S. mutans впервые привлек внимание врачей благодаря своей роли в развитии кариеса. S. mutans считается частью нормальной флоры ротоглотки, а точнее зубного налета, и может образовывать биопленки на твердой поверхности зубов. Было показано, что штаммы бактерий, вызывающие эндокардит, способны связываться с коллагеном типов I, III и IV, которые являются основными компонентами сердечно-сосудистых тканей хозяина. Бактерии также обладают факторами вирулентности, которые могут вызывать сильную адгезию к эндотелиальным клеткам человека. Кроме того, агрегация и взаимодействие с фибриногеном, тромбоцитами и комплементом позволяют этим бактериям вызывать сердечно-сосудистые заболевания.    При инфекционном эндокардите в 20% случаев обычные методы, такие как микробиологические культуры, дают отрицательный результат. Несколько исследований показали, что в образцах от пациентов с эндокардитом секвенирование 16s рРНК может правильно определить организм, выросший в культуре, но также успешно обнаружить организмы в образцах, где не было роста, что позволяет клиническим специалистам эффективно лечить пациентов, как в нашем случае.     Для тканей протезов сердечных клапанов чувствительность секвенирования по сравнению с культурой составляет 93% и 35%, соответственно. Исследование, описывающее инфекции перипротезных суставов с использованием жидкости из локтевого сустава, показало, что секвенирование было положительным в 47 образцах, но 8% из них были отрицательными в культуре. Кроме того, секвенирование 16s рРНК оказалось полезным для идентификации бактериальных клещевых инфекций, которые не растут на плотных средах, таких как Borrelia, Anaplasmsa, Ehrlichia и Rickettsia.    Тест BRBPS в идеале должен проводиться на образцах из стерильных источников (суставная жидкость, кровь, сердечные клапаны, ЦСЖ). Идеальными образцами являются те, в которых бактериальные организмы можно визуализировать с помощью микроскопии. Ограничения BRBPS заключаются в том, что этот тест выявляет только бактериальные организмы и не обнаруживает вирусы, грибки и паразитов. Ложноположительные результаты возможны, если образец контаминирован флорой пациента. Ложноотрицательные результаты могут возникать из-за изменчивости последовательности, влияющей на связывание праймеров, наличия ингибиторов ПЦР или количества нуклеиновой кислоты ниже предела обнаружения.     Клинические тесты с использованием методов секвенирования могут быть на сегодняшний день дорогостоящими; те, кто заказывает тесты с использованием секвенирования, должны понимать назначение различных тестов с использованием секвенирования, чтобы заказать наиболее подходящий тест. Например, если есть подозрение на грибковые патогены, подойдет тест на секвенирование, основанный на амплификации генов 28S рРНК или рибосомального ITS для консервативных генов, встречающихся у грибковых патогенов. Такие тесты, где вы избирательно обогащаете специфические мишени, такие как 16s или ITS, являются "целевыми NGS-тестами", которые имеют более высокую чувствительность для обнаружения микроорганизмов в образцах с большим количеством ДНК.     Для сравнения, метагеномика является более универсальным подходом и позволяет обнаружить все нуклеиновые кислоты в образце (включая считывания как хозяина, так и микроорганизмов). Хотя метагеномика может успешно обнаружить патогены, участвующие в инфекции, она также может обнаружить микробиом, присутствующий в том же образце. Следовательно, единственным ограничением является фоновый шум от нуклеиновой кислоты человека и микрофлоры.    Другим видом секвенирования является полногеномное секвенирование (WGS), при котором секвенируется микробный геном конкретного организма. WGS помогает в идентификации, типировании и определении чувствительности микроорганизмов. WGS полезен при выявлении вспышек заболеваний или в эпидемиологических целях, но его ограничение заключается в том, что необходима чистая культура, что является ограничением для организмов, которые нежизнеспособны в культуре.