Новости

Антибиотики стали жертвой собственного успеха, поскольку появление бактерий, резистентных к антибиотикам, угрожает здоровью населения во всем мире.    Это привело не только к увеличению смертности, но и к росту расходов на здравоохранение. Еще больше осложняет проблему медленный темп разработки ранее не известных антибиотических и неантибиотических подходов к лечению инфекций. Соответственно, необходимо понять механизмы, с помощью которых бактерии противостоят существующим антибиотикам, чтобы продлить срок их использования.    Большинство исследований, направленных на понимание резистентности к антибиотикам, было сосредоточено на поведении отдельных бактерий. Однако растет понимание того, что динамика бактериальной популяции также может обуславливать резистентность. К ним относятся, например, распространение конъюгативных плазмид, придающих резистентность к антибиотикам и инактивация антибиотиков посредством коллективной деградации. Общее понимание того, как бактериальные популяции сопротивляются антибиотикам, имеет отношение к эволюции самой резистентности, к тому, как механизмы резистентности формируют микробную экологию в неклинических условиях и к лечению инфекционных заболеваний.    Одним из широко наблюдаемых механизмов, который популяция бактерий может использовать для обеспечения устойчивости к антибиотикам, является эффект инокулята (ЭИ). В этом случае начальная плотность бактериальной популяции определяет ее минимальную ингибирующую концентрацию (МИК). Для данной концентрации антибиотика популяция, возникшая при достаточно высокой плотности, будет расти и выживать. В противном случае, при той же концентрации антибиотика, если начальная плотность популяции слишком низкая, популяция не будет расти.     ЭИ наблюдается практически для всех бактерий и антибиотиков, может возникать лишь при небольших различиях в начальной плотности популяции и может возникать в отсутствие генетически закодированных механизмов резистентности. В клинических условиях сообщалось об резистентности к антибиотикам, вызванной ЭИ. Повышение концентрации антибиотиков для борьбы с ЭИ может быть нецелесообразным, поскольку высокие концентрации антибиотиков могут иметь негативные последствия для здоровья. Лечение инфекций высокой плотности стандартными концентрациями антибиотиков может привести к появлению дополнительных механизмов резистентности. Необходима разработка подходов к лечению бактериальных инфекций высокой плотности.    Большинство механизмов, которые использовались для объяснения ЭИ, основываются на динамике роста или соотношении антибиотика и мишени. Также было предложено несколько антибиотикоспецифических механизмов для объяснения ЭИ, включая индуцированную деградацию мишени антибиотика бактериальными протеазами, дифференциальную скорость роста и коллективную инактивацию антибиотиков. Однако эти механизмы не могут объяснить ЭИ для различных классов антибиотиков, многие из них еще предстоит проверить экспериментально, и они в целом не дают информации о стратегиях рационального снижения или устранения ЭИ. Для разработки стратегий по снижению или устранению ЭИ важно обнаружить механизм, который может объяснить ЭИ для всех классов антибиотиков.    Хотя скорость роста бактерий изначально считалась предиктором эффективности антибиотиков, недавно было показано, что состояние метаболизма бактерий лучше предсказывает эффективность антибиотиков; при неизменной скорости роста увеличение концентрации АТФ в клетке увеличивает бактерицидную летальность антибиотиков. Этот вывод имеет непосредственное отношение к ЭИ, поскольку плотность бактерий и концентрация АТФ взаимосвязаны.     В закрытой системе высокоплотные популяции, например, находящиеся в стационарной фазе, имеют пониженную концентрацию АТФ из-за истощения питательных веществ. Популяции с более быстрыми темпами роста, например, находящиеся в лог-фазе, имеют повышенную концентрацию АТФ. В контексте ЭИ средняя концентрация АТФ в популяции в значительной степени определяется ее начальной плотностью. Бактерии, заселенные с высокой плотностью, будут испытывать короткий период роста до вступления в стационарную фазу, что приведет к снижению концентрации АТФ и, следовательно, к снижению эффективности антибиотиков.     При одинаковой несущей способности бактерии, инициированные с более низкой плотности, имеют более длительный период роста в лог-фазе перед переходом в стационарную фазу. Это увеличивает время, в течение которого концентрация АТФ в клетке высока, что усиливает летальность антибиотиков. Хотя рост и использование энергии могут положительно коррелировать, они не являются строго связанными, и их взаимосвязь зависит от среды роста (например, питательных веществ, температуры и т.д.). Например, быстрый рост может совпадать с уменьшением выработки АТФ, а медленный рост - с увеличением выработки АТФ.    Хотя взаимодействие между плотностью клеток и производством АТФ может объяснить ЭИ для бактерицидных антибиотиков, большинство существующих механизмов, объясняющих ЭИ, не учитывают изменения в энергетическом статусе бактерий). Соответственно, мы задались вопросом, может ли взаимодействие между скоростью роста и концентрацией АТФ объяснить ЭИ для бактерицидных антибиотиков. Ответ на этот вопрос может позволить разработать протоколы для более эффективного лечения бактериальных инфекций высокой плотности.    В данном исследовании мы показали, что продуктивность роста, комбинированный эффект роста и метаболизма, может объяснить ЭИ для нескольких бактерицидных антибиотиков и видов бактерий. Руководствуясь анализом баланса потоков и моделированием всего генома, мы продемонстрировали, что источник углерода, поставляемый в ростовую среду, определяет продуктивность роста. Если продуктивность роста достаточно высока, ЭИ устраняется. Наши результаты могут привести к разработке подходов к снижению ЭИ в клинике, помочь стандартизировать анализ антибиотиков и углубить наше понимание того, как бактерии развивают резистентность.

В конце 1890-х годов Альфред МакКонки работал в Ливерпульском университете под эгидой Королевской комиссии по очистке сточных вод.     Этой группе было поручено защитить население от заболеваний, передающихся через воду, путем разработки передовых методов очистки сточных вод. Чтобы оценить эффективность различных режимов очистки сточных вод, комиссия обязательно должна была определить, остается ли очищенная вода загрязненной фекалиями.    Часть работы МакКонки в комиссии заключалась в исследовании источников питьевой воды на наличие грамотрицательных энтеральных организмов. Эти бактерии являются нормальными обитателями желудочно-кишечного тракта человека, а также встречаются у других млекопитающих, рептилий и птиц. Хотя сами они не всегда вызывают заболевания, их присутствие является индикатором фекальной контаминации и, следовательно, потенциального присутствия других патогенов, передающихся с фекалиями.    Для идентификации энтеральных организмов образцы воды высевали на твердые среды, а образовавшиеся колонии подсчитывали и идентифицировали. Однако усилия МакКонки не были успешными из-за того, что каждый миллилитр очищенной воды мог по-прежнему содержать сотни или тысячи бактерий. Многие из этих организмов, которые МакКонки называл "обычными земными организмами", не предсказывали загрязнения. Неудивительно, что в его образцах часто вырастало большое количество колоний на стандартных питательных средах. Несмотря на разбавление, оказалось трудно идентифицировать энтеральные микроорганизмы, которые могли там присутствовать.    Поэтому МакКонки нужен был способ ограничить этот фон флоры окружающей среды и позволить расти только интересующим его бактериям. Среды, которые могут выполнять эту функцию, сегодня известны как селективные среды. Его стратегия отбора энтеральных организмов заключалась в добавлении желчных кислот в стандартную среду. Желчные кислоты - это амфипатические молекулы, обнаруженные в кишечнике, которые помогают пищеварению, эмульгируя жиры и позволяя им транспортироваться в водной среде.    Клеточные мембраны также очень похожи на жировые, поэтому желчные кислоты токсичны для многих организмов из-за способности нарушать этот барьер. Энтеральные организмы, однако, должны выдерживать постоянную атаку желчных кислот в кишечнике и поэтому выработали механизмы сопротивления их действию. Поэтому энтерики (и некоторые другие грамотрицательные бактерии, в частности, Pseudomonas) проходят отбор на средах, содержащих желчь.    Помимо обогащения для грамотрицательных бактерий, МакКонки также хотел иметь возможность различать типы энтеральных организмов. Особый интерес представляло определение того, является ли колония Escherichia coli (тогда Bacillus coli communis) или Salmonella enterica serovar Typhi (тогда B. typhi abdominalis). Хотя для окончательной идентификации этих организмов требовались дополнительные исследования, Макконки использовал предыдущее наблюдение Теодора Эшериха (в честь которого назван род Escherichia) о том, что E. coli ферментирует лактозу, тогда как Salmonella не ферментирует лактозу, чтобы быстро исключить или не исключить эти организмы на глаз. Эта среда была изготовлена с использованием современных компонентов бактериологических сред в соответствии с оригинальной рецептурой Макконки, опубликованной в журнале The Lancet в 1900 году. Чистая дезоксихолевая кислота заменила смесь гликолевой кислоты и таурохолевой кислоты, первоначально используемую МакКонки. На фото А показана Escherichia coli, ферментирующая лактозу. Белый цвет вокруг колонии представляет собой осадок желчи. На фото Б показана Klebsiella pneumoniae. Хотя этот организм также ферментирует лактозу, он не производит достаточно кислоты для осаждения желчи и на этой среде выглядит как неферментирующий. На фото С показана Pseudomonas aeruginosa, неферментирующая лактозу. Источник: K.P. Smith.    Когда бактерии ферментируют сахар, pH среды становится кислым. Конечно, кислотность нельзя наблюдать напрямую, поэтому ферментация сахаров традиционно оценивалась в бульонных средах, содержащих химический индикатор pH (часто лакмус). Однако если бульонные среды содержали более одного организма, как это часто случалось с образцами воды Макконки, любые ферментирующие бактерии понижали рН и скрывали присутствие неферментирующих организмов. Макконки нужен был способ оценки ферментации лактозы на отдельных колониях на твердой среде. Для этого он ввел лактозу непосредственно в агар. Изменения pH, связанные с ферментацией, наблюдались с учетом того, что желчные кислоты выпадают в осадок в кислой среде. Таким образом, колонии, ферментирующие лактозу, были окружены дымкой осажденной желчи.    После того, как первое описание агара МакКонки было опубликовано в журнале The Lancet в 1900 году, эта среда стала быстро использоваться теми, кто интересовался микробиологией воды. Однако другие ученые признали, что оригинальный рецепт Макконки имел некоторые ограничения. Одним из них была сложность оценки ферментации лактозы в организмах, которые в процессе ферментации не вырабатывали достаточно кислоты для осаждения желчи. Чтобы решить эту проблему, Альберт Грюнбаум и Эдвард Хьюм добавили нейтральный красный, индикатор рН, который переходит от желтого цвета при основном рН к красному при кислом или нейтральном рН. Это добавление позволило повысить чувствительность обнаружения ферментации лактозы.    Еще одним ограничением было то, что желчь была единственным селективным агентом, что позволяло расти грамположительным организмам, устойчивым к желчи. Модификация Грюнбаума и Хьюма дополнительно содержала кристаллический фиолетовый, краситель, который, как ранее показали Вильгельм фон Дригальски и Генрих Конради, ингибирует грамположительные микроорганизмы. Это добавление было важно для повышения селективности, чтобы исключить Enterococcus spp.    К 1930 году в справочнике микробиологических сред было опубликовано 10 модификаций агара МакКонки. Они включали вариации содержания желчи, замену лактозы другими сахарами, изменение показателя pH или добавление неорганических солей. Среди всех этих вариантов именно формула Грюнбаума и Хьюма выдержала испытание временем и является (с небольшими изменениями) основой современного агара МакКонки. Современный, коммерчески доступный агар МакКонки. На фото А показана Escherichia coli, ферментирующая лактозу. Обратите внимание на непрозрачный розовый желчный осадок вокруг колоний. На фото Б показана Klebsiella pneumoniae, также ферментирующая лактозу. Колонии розовые, что указывает на выработку кислоты, но желчный осадок отсутствует. На фото С показана Pseudomonas aeruginosa, неферментирующая лактозу. Источник: K.P. Smith.    Почти 120 лет спустя агар МакКонки по-прежнему широко распространен в клинических лабораториях, где он регулярно используется для выделения неспорообразующих грамотрицательных организмов из культур ран, мочи, кала и крови. Кроме того, он как важный инструмент для тестирования качества воды. Несмотря на фундаментальные изменения в микробиологической практике, включая автоматизацию, молекулярную генетику и масс-спектрометрию, представляется невероятным, что среда МакКонки по-прежнему будет использоваться в обозримом будущем.